Мы описываем низкая стоимость, высокая пропускная способность метода для выявления грибковых деятельности в эндоглюканазы Е. палочки. Метод основан на простой визуальный отсчет деградации субстрата, не требует очистки фермента, и является масштабируемой. Это дает возможность быстрого скрининга больших библиотек фермента вариантов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ферменты целлюлазы (эндоглюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы) гидролизуют целлюлозу до простых сахаров, которые, в свою очередь, могут быть преобразованы в топливные спирты1. Потенциал ферментативного гидролиза целлюлозной биомассы для получения возобновляемой энергии усилил стремление к инженерии целлюлаз для экономичного производства топлива2. Особый интерес представляют грибковые целлюлазы3-8, которые уже используются в промышленности для переработки пищевых продуктов и текстиля.
Идентификация активных вариантов в библиотеке мутантных целлюлаз имеет решающее значение для процесса инженерии; активные мутанты могут быть подвергнуты дальнейшему тестированию на улучшение свойств и/или дополнительному мутагенезу. Эффективная инженерия грибковых целлюлаз была затруднена отсутствием генетического инструментария для нативных организмов, а также сложностями экспрессии ферментов в гетерологичных хозяевах. Недавно Морикава и коллеги разработали метод экспрессии в E. coli каталитических доменов эндоглюканаз из H. jecorina3,9 — важного промышленного гриба, способного секретировать целлюлазы в больших количествах. Функциональная экспрессия в E. coli также была зарегистрирована для целлюлаз других грибов, включая Macrophomina phaseolina10 и Phanerochaete chrysosporium11-12.
Мы представляем метод высокопроизводительного скрининга активности грибной эндоглюканазы в E. coli. (Рис. 1) В данном методе используется распространенный микробиологический краситель конго красный (CR) для визуализации ферментативной деградации карбоксиметилцеллюлозы (CMC) клетками, растущими на твердой среде. Анализ активности требует недорогих реагентов, минимального количества манипуляций и дает однозначные результаты в виде зон деградации («гало») в месте расположения колонии. Хотя с помощью этого метода невозможно определить количественную меру ферментативной активности, мы обнаружили, что размер гало коррелирует с общей ферментативной активностью в клетке. Дальнейшая характеристика отдельных положительных клонов позволит определить относительную пригодность белков.
Традиционные методы анализа активности КМЦ/ЦР целых бактериальных клеток13 предполагают выливание агара с КМЦ на колонии, что чревато перекрестным загрязнением, или инкубацию культур в лунках с КМЦ-агаром, что менее удобно для крупномасштабных экспериментов. Здесь мы представляем усовершенствованный протокол, который модифицирует существующие методы промывки14 для определения активности целлюлазы: клетки, выращенные на чашках с КМЦ-агаром, удаляют перед окрашиванием на ЦР. Наш протокол значительно снижает вероятность перекрестного загрязнения и обладает высокой масштабируемостью, что позволяет проводить быстрый скрининг тысяч клонов. Помимо ферментов H. jecorina, мы экспрессировали и проанализировали варианты эндоглюканазы из Thermoascus aurantiacus и Penicillium decumbens (показаны на Рисунке 2), что свидетельствует о применимости данного протокола к ферментам из различных организмов.
Протокол
1. Подготовка Скрининг пластины
- Добавить 25 г средний рост Л.Б., 15 г агара и 1,5 г карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) субстрата 1л дистиллированной воды, и автоклав для стерилизации.
- После автоклавирования среду позволяют охладить и добавить соответствующие антибиотики, и IPTG к конечной концентрации 100 мкм.
- Залить 200 мл каждая среда в 5 больших квадратных чашках Петри / биопроб лотки (240 х 240 х 20 мм и более). Разрешить пластины до полного высыхания.
2. Эндоглюканазы поколения библиотеки и экран
- Создание библиотеки эндоглюканазы каталитический домен (ы). Это может быть достигнуто разными способами (например, сайт-направленного мутагенеза или случайного, рекомбинации и т.д.) и определяется исследователем.
- Клон библиотеки в такой вектор, что они находятся под контролем промотора T7 с оператором лак, и содержат pelB сигнальной последовательности для ориентации в периплазме. Примером подходящего вектора pET22b (+) от Novagen.
- Преобразование эндоглюканазы библиотеки в E. палочки штамма BL21 (DE3) и пластины для отдельных колоний.
- Инкубируйте преобразования ночи при 37 ° C.
- Использование стерильных зубочистки, привить клонов в 96 и глубоких скважин чашки, содержащие 400μL средой LB добавлены все необходимые антибиотики. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи при встряхивании при 250 оборотах в минуту.
- Добавить стерильным глицерином до 96 и ночью культур к конечной концентрации 10% для длительного хранения при температуре -80 ° C. Это будет мастер пластины.
- Использование 96-контактный штамп, повторить пластины ночь культур на скрининг чашки, содержащие IPTG и КМЦ. До 5 наборов ночь культур может нанести на каждый скрининга пластины.
- Этикетка скрининга пластин, так что личность и ориентация каждого 96-луночного планшета известно.
- Инкубируйте штамп библиотеки при комнатной температуре (17-25 ° С) в течение ночи или пока не видимые колонии образовали.
- Промыть пластины с дистиллированной водой, пока все следы колонии удаляются.
- Налейте конго красный (CR, 0,5% в воде) на мыть тарелку. Убедитесь в том, чтобы добавить ровно столько, чтобы покрыть CR пластины.
- Инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Не превышать 15 минут для инкубации ЧР. Дольше время инкубации приведет к менее выраженным гало.
- Вылейте CR и добавить большое количество (более чем достаточно, чтобы покрыть пластины) 1 М NaCl.
- Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
- Вылейте NaCl выявить CMC ореолы деградации. Для лучшего разрешения ореолы, больше времени инкубации с NaCl или нескольких NaCl моет могут потребоваться.
- Использование стерильных зубочистки, выбрать активную клонов ферментов из мастер пластина для дальнейшей характеристики.
3. Представитель Результаты:
Пример считывания для этого экран высокого пропускной показано на рисунке 3. Клоны могут быть идентифицированы как неактивные, слабо активны, и очень активный в зависимости от размера деградации зон. Это особенно полезно, если фермент известных деятельность включена в библиотеку в качестве эталона. Как показано здесь, идентификация активных ферментов является надежной и воспроизводимой. Тем не менее, необходимо учитывать, что адекватное маркировки скрининга пластин является чрезвычайно важным. Исследователь должен быть в состоянии идентифицировать активные варианты после мытья колонии далеко, для того, чтобы отобрать их у мастера пластины хранят при -80 ° С для дальнейшей характеристики. Наконец, трудно оценить априорное отношение между деятельностью на искусственном против природных субстратов. Таким образом, исследователь должен проверить все положительные клоны на промышленно соответствующие материалы для определения белка фитнеса.
Рисунок 1. Схема контур процедура отбора. Клетки переходят с эндоглюканазы библиотеки и покрытием выборочно для отдельных колоний. Клоны собирают и выращивают в течение ночи на 96 и глубокий колодец пластин для (1) хранение при температуре -80 ° С и (2) реплики покрытие на пластинах содержащих КМЦ и IPTG, чтобы побудить эндоглюканазы выражения. Активная клоны выбрать из мастер пластины хранятся при температуре -80 ° C.
Рисунок 2. Клонирование и экспрессия грибковых каталитических доменов в E. палочки. (А) эндоглюканазы вектор экспрессии. Гены были клонированы в pET22b (+) (Novagen) под контролем промотора Т7. (B) правой панели: эндоглюканазы экспрессирующих BL21 (DE3) колоний. Левая панель: CMC ореолы деградации после мытья и развития с конго красный.
Рисунок 3. Пример результатов от CMC / Конго экране красный. Снимки, сделанные скрининга пластин после мытья и конго красный развития. Все колонии на Screening пластины такого же размера.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный здесь, позволяет быстро и высокую пропускную способность идентификации активных ферментов, с минимальной манипуляцией. Обнаружение активности является достаточно чувствительным, и качественно отражает количество активности внутри клетки. Его простота использования делает этот метод подходит для широкого спектра ферментов библиотеки, ограничивается только функциональное выражение в E. палочки. Кроме того, деятельность скрининга такого рода не ограничивается грибковые целлюлазы, но может быть ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансировалась Гордона и Бетти Мур Фонда, а также UNCF / Merck Научная инициатива.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент | Компания | Номер изделия | |
| IPTG | Сигма | I1284 | |
| Конго красный | Сигма | C6277 | |
| Карбоксиметилцеллюлоза | Сигма | 360384 | |
| NaCl | Сигма | S1679 | |
| Бакто-агар | BD Biosciences | 214030 | |
| Биопроб пластин | Thermo Scientific | 240845 |
Ссылки
- Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451, 86-89 (2008).
- Wilson, D. B. Cellulases and biofuels. Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).
- Qin, Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).
- Nakazawa, H. Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei. Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).
- Heinzelman, P. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).
- Heinzelman, P. SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability. J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).
- Lantz, S. E. Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering. Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).
- Mahadevan, S. A. Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).
- Nakazawa, H. Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).
- Wang, H., Jones, R. W. Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems. Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).
- Howard, R. L. Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).
- Howard, Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli. Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Gilkes, N. R. Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes. J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
