CRISPR-опосредованные инструменты редактирования оснований: метод редактирования генома для индуцирования целевой замены оснований

1. Создание вариантов BRCA1 с помощью инструментов редактирования базы, опосредованных CRISPR

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточные линии HAP1-BE3 не используются, BE3-кодирующая плазмидная ДНК может быть совместно трансфицирована с BRCA1-нацеленной гРНК. По сравнению с котрансфекцией плазмид BE3 и гРНК, трансфекция плазмиды гРНК в клетки HAP-BE3 индуцирует эффективное редактирование оснований до 3 раз в целевом локусе в наших руках.

1. Затравите 5 x 10⁵ клеток HAP1-BE3 (или клеток HAP1 в случае методов котрансфекции) в лунку в 24-луночные планшеты за 1 день до трансфекции. К моменту трансфекции культивируемые клетки достигают соответствующей плотности (70%–80% конфлюенции).
2. Трансфектируйте гРНК, нацеленные на BRCA1, с использованием приобретенных реагентов для трансфекции (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя. Используйте 1 г гРНК, нацеленных на BRCA1 (с 1 г BE3-кодирующей плазмидной ДНК в случае методов котрансфекции) для индуцирования преобразования C:G в T:A в сайтах-мишенях BRCA1. Инкубируйте клетки при 37 °C и субкультурируйте каждые 3–4 дня.
3. Соберите клеточные гранулы через 3, 10 и 24 дня после трансфекции для анализа эффективности редактирования базы (образцы, полученные через 3 дня после перефикации, анализируются с сортировкой как образцы дня 0).
4. Извлечь геномную ДНК с помощью набора для очистки геномной ДНК (Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем оптимизировать условия трансфекции с переменным соотношением реагента к ДНК. Оптимальным условием для трансфекции HAP1 является соотношение реагента к ДНК в наших руках 4:1.