1. Приготовление буферов и растворов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы и решения, используемые в протоколе, сведены в Таблицу 1. Заданных объемов буферов достаточно для подготовки и прогона 10 образцов. Все буферы могут храниться при температуре +4 °C до одного года.
- Приготовьте 20 мл 3x гелевого буфера, содержащего 1,5 М аминокапроновой кислоты, 150 мл Bis-tris в дистиллированной воде (dH2O). Отрегулируйте pH до 7,0.
- Приготовьте 10 мл 2 М аминокапроновой кислоты вdH2O.
- Приготовьте 1 мл митохондриального буфера, соединив следующее: 0,5 мл 3x гелевого буфера, 0,5 мл 2 М аминокапроновой кислоты и 4 мкл 500 мМ ЭДТА.
- Приготовьте 1 000 мл катодного буфера, содержащего 15 мМ бис-триса и 50 мМ трицина в dH2O. Отрегулируйте pH до 7,0.
- Приготовьте 200 мл синего катодного буфера, добавив 0,04 г синего Кумасси G-250 к 200 мл катодного буфера.
- Приготовьте 1 000 мл анодного буфера, содержащего 50 мМ бис-трис в dH2O. Отрегулируйте pH до 7,0.
- Приготовьте 2,5 мл буфера для образца, содержащего 750 мМ аминокапроновой кислоты и 5% Coomassie blue G-250 в dH2O.
2. Получение митохондриальных лизатов
- Нанесите тарелки на клетки за день до сбора. Для клеток HEK293 или 143B используйте модифицированную среду Дульбекко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 100 мг/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Выращивайте клетки в инкубаторе для клеточных культур при температуре +37 °C в увлажненной атмосфере с содержаниемCO2 5%. Убедитесь, что в день забора на каждый образец имеется не менее 500 000 клеток.
- Аккуратно промойте клетки один раз ледяным PBS. Избегайте отсоединения ячеек от пластины. Соскребите клетки и гранулируйте их при 800 x g в течение 10 минут при температуре +4 °C.
- Дважды промойте гранулу ячейки ледяным PBS и центрифугой, как в шаге 2.2. Измерьте концентрацию белка по методу Брэдфорда с помощью коммерческого набора. Гранулируйте ячейки при 800 x g в течение 10 мин при +4 °C.
заметка: После забора клеток выполняйте все действия при температуре +4 °C и не делайте вихрей.
- Приготовьте 20 мл PBS с ингибитором протеазы, добавив 200 мкл 100-кратного ингибитора протеазы к 20 мл PBS. Держите на льду. Ресуспендируйте клетки в PBS ингибитором протеазы до конечной концентрации белка 5 мг/мл.
- Чтобы рассчитать объем PBS с ингибитором протеазы, необходимым для ресуспендирования клеток при 5 мг/мл, рассчитают количество белка в каждом образце. Для этого расчета используют концентрацию белка, измеренную на шаге 2.3, и объем PBS, используемый для ресуспендирования клеток после промывки на шаге 2.3.
- Приготовьте 1 мл 3,3 мМ дигитонина в PBS с ингибитором протеазы. Добавьте 3,3 мМ дигитонина к конечной концентрации 1,65 мМ. Хорошо перемешать и выдерживать на льду 5 минут.
- Для приготовления 1 мл 3,3 мМ дигитонина в PBS с ингибитором протеазы растворите 4 мг дигитонина в 1 мл PBS при 100 °C до тех пор, пока не исчезнет осадок, и немедленно охладите на льду. Добавьте 10 мкл 100-кратного ингибитора протеазы в 1 мл раствора дигитонина.
заметка: Используйте только свежий раствор дигитонина.
осторожность: Дигитонин токсичен! Используйте маску для лица, перчатки и лабораторный халат.
- Добавьте PBS с ингибитором протеинады (приготовленным на шаге 2.4) до конечного объема 1,5 мл. Центрифугируйте при 10 000 x g в течение 10 мин при +4 °C. Удалите надосадочную жидкость. На этом этапе митохондрии гранулируются.
- Ресуспендируйте митохондриальную гранулу в митохондриальном буфере. Объем митохондриального буфера составляет половину объема PBS на шаге 2.4.
- Приготовьте свежий 10% лаурилмальтозид в PBS, содержащий ингибитор протеазы (приготовленный на шаге 2.4). Достаточно 1 мл для 10 образцов. Добавьте 10% лаурилмальтозида к конечной концентрации 1%. Инкубируйте на льду в течение 15 минут (этот этап может быть дольше до пары часов).
- Центрифугируйте при 20 000 x g в течение 20 мин при +4 °C. Соберите надосадочную жидкость в новую пробирку. Измерьте концентрацию белка по методу Брэдфорда с помощью набора. Добавьте буфер для образцов, объем которого составляет половину объема лаурилмальтозида, используемого на шаге 2.8. Образцы могут храниться при температуре -80 °C до 6 месяцев.
3. Приготовление градиентного геля для BN-PAGE
- Налейте градиентный гель для BN-PAGE комнатной температуры. Поместите градиентный генератор на пластину для перемешивания и подсоедините его с помощью гибкой трубки к перистальтическому насосу. Приложите инфузионный набор с иглой к трубке. Поместите магнитную мешалку в проксимальную камеру градиентного генератора. Промойте трубку с помощью dH2O на максимальной скорости насоса в течение 10 минут.
- Опорожните трубку и градиентный генератор. С помощью пипетки удалите остатки dH,2O в канале между камерами градиентного генератора. Закройте канал и трубку с помощью клапана.
- С помощью литой рамы и хомутов соберите две стеклянные пластины в держатель, который имеет отверстие на дне, и поместите его на подставку. Следите за тем, чтобы он находился более-менее на прямой поверхности с водным балансом. Поместите иглу, соединенную с трубкой, между стеклянными пластинами.
- Приготовьте 6% и 15% растворы геля (табл. 2). Держите на льду. В последнюю очередь добавляйте персульфат аммония (APS) и тетраметилендиамин (TEMED) (они запускают полимеризацию). Аккуратно перемешивайте, чтобы не образовались пузырьки воздуха.
- Загрузите проксимальный конец трубки смесителя с градиентным гелем 6% геля, а дистальный конец - 15% геля. Общий объем геля должен быть равен объему разделительного геля между стеклянными пластинами. Таким образом, используйте 2,6 мл 6% геля и 2,1 мл 15% геля в градиентном смесителе для одного геля размером 8,3 см х 7,3 см.
- Включите магнитную мешалку, откройте трубку и канал между камерами градиентного генератора. Немедленно включите перистальтическую помпу на 5 мл/мин. Заполните стеклянные пластины, и не допускайте попадания пузырьков в гель. Извлеките иглу, когда в трубке нет геля.
- Аккуратно нанесите на гель dH2O. Держите гель при комнатной температуре не менее 1 часа для полимеризации.
- Сразу после заливки геля промойте трубку, заполнив градиентные камеры dH2O и используя перистальтический насос на максимальной скорости. При приготовлении двух и более гелей всегда очищайте систему между ними.
- Приготовьте 1x гелевый буфер, смешав 3 мл 3x гелевого буфера и добавив 6 мл dH2O. Аккуратно удалите dH2O с поверхности геля с помощью фильтровальной бумаги. Промойте поверхность геля с помощью 1x гелевого буфера. Аккуратно удалите 1x гелевый буфер с помощью фильтровальной бумаги.
- Избегайте попадания волокон из фильтровальной бумаги на геле. Чтобы обеспечить это, нарежьте бумагу на небольшие кусочки ножницами, но не рвите бумагу.
- Поместите расческу между стеклянными пластинами, но не погружайте ее полностью, чтобы можно было вылить стекающий гель под расческу. Приготовьте 4% укладывающий гель (Таблица 2). Добавляйте APS и TEMED в последнюю очередь, так как они легко начинают полимеризацию. Аккуратно перемешивайте, не допуская появления пузырьков воздуха.
- Нанесите гель для укладки, избегая пузырей под расческой, и полностью погрузите расческу. Дайте укладывающему гелю полимеризоваться не менее 30 минут. Снимите расческу и промойте лунки 1х гелевым буфером с помощью пипетки.
- После полимеризации гель можно хранить при температуре +4 °C в течение пары дней. Для хранения геля заверните гель в бумагу, смоченную dH2O и полиэтиленовую пленку, чтобы предотвратить высыхание геля.
4. Электрофорез в синем нативном геле
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить деградацию комплексов OXPHOS, проведите электрофорез при +4 °C. Используйте предварительно охлажденные буферы.
- Загрузите в гелевую кассету синий катодный буфер до дна лунок. Загрузка образцов облегчается, когда кассета не заполнена доверху. Промойте лунки синим катодным буфером, а затем заполните лунки синим катодным буфером с помощью пипета.
- Загрузите образцы (5-30 мкг белка) в лунки. Аккуратно заполните гелевую кассету доверху синим катодным буфером и бак с анодным буфером.
- Запустите гель в течение 15 минут при постоянном напряжении 40 В. Затем увеличьте напряжение до 80 В (или используйте постоянный ток 6 мА), не превышайте 10 мА. Наносите гель до тех пор, пока краситель не достигнет 2/3 длины геля.
- Замените синий катодный буфер на катодный и продолжайте электрофорез до тех пор, пока не закончится фронт красителя. В общей сложности электрофорез занимает около 3 часов.
- Извлеките стеклянные пластины и перенесите белки на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью полусухой промокательной обработки.