$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Функционализация матрицы с биотинилированным антителом
- Приготовьте следующие растворы.
- T50 Buffer, раствор 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) и 50 мМ NaCl. Раствор стабилен в течение 1 месяца по РТ.
- Т50-БСА путем добавления буфера Т50 с 0,1 мг/мл БСА. Приготовленный раствор держать на льду.
- 10 мг/мл борогидрида натрия (NaBH4) в 1x PBS. Приготовьте это непосредственно перед использованием.
- 0,2 мг/мл NeutrAvidin (см. Таблицу материалов) в буфере T50.
осторожность: NaBH4 является восстановителем и легковоспламеняющимся. Всегда продувайте емкость газообразным азотом после использования и храните ее в эксикаторе.
- Функционализируйте матрицу с помощью биотинилированного антитела.
- Извлеките функционализированные массивы ПЭГ-биотина из морозильной камеры и уравновесьте коническую трубку до состояния RT перед открытием. Поместите покровное стекло так, чтобы массив был направлен вверх, на чашку для культуры тканей толщиной 100 мм (TC100), выстланную герметической пленкой.
заметка: Сведите к минимуму верхнее освещение. Все растворы должны «нарастать» на квадратах, определенных гидрофобной матрицей. Добавьте соответствующий объем раствора, чтобы полностью покрыть каждый квадрат (обычно 10-15 мкл) и не допускайте выхода жидкости за пределы определенного пространства. Для быстрого удаления жидкостей используйте собственную вакуумную линию, прикрепленную к вакуумной колбе для улавливания отходов. Дайте NaBH4 дегазироваться в течение 1 часа перед утилизацией, оставив пробирку открытой в вытяжном шкафу для химических веществ. Обработка NaBH4 необходима для снижения фоновой аутофлуоресценции, тем самым уменьшая ложноположительные обнаружения одиночных молекул .
- Обработайте каждый квадрат матрицы 10 мг/мл NaBH4 в 1x PBS в течение 4 минут при RT. Промойте три раза PBS. Промойте три раза PBS.
- Инкубируйте каждый квадрат в течение 5 минут с 0,2 мг/мл NeutrAvidin в T50. Трижды постирать T50-BSA.
заметка: NeutrAvidin связывается с ПЭГ-биотином и обеспечивает сайт связывания для биотинилированных антител.
- Инкубируйте каждый квадрат в течение 10 минут с 2 мкг/мл биотинилированного POI-специфического антитела в T50-BSA; трижды промойте T50-BSA.
заметка: В настоящем протоколе используется биотинилированный анти-EGFR IgG (см. Таблицу материалов) для захвата EGFR-GFP.
2. SiMPull POI из цельноклеточных лизатов
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите чашку TC100 с функционализированными массивами SiMPull на лед до конца приготовления SiMPull. Этот этап представляет собой извлечение POI из общего лизата белка. Лизат нельзя использовать повторно после размораживания.
- Приготовьте следующие растворы.
- Приготовьте 4% параформальдегида (PFA)/0,1% глутаральдегида (GA) в 1x PBS.
осторожность: ПФА и ГА являются токсичными химическими фиксаторами и потенциальными канцерогенами. Надевайте СИЗ. Утилизируйте химические вещества как опасные отходы в соответствии с местными правилами и рекомендациями.
- Приготовьте 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4.
- Разморозьте и перемешайте лизат, аккуратно пипетируя вверх и вниз. Держите на льду.
- Развести 1 мкл лизата в 100 мкл ледяного T50-BSA/PPI.
заметка: При необходимости определите соответствующий коэффициент разбавления общего лизата белка путем применения ряда разведений к матрице. Оптимальная плотность рецепторов SiMPull на площадь матрицы составляет 0,04-0,08/мкм2.
- Инкубируйте лизат на массиве в течение 10 минут, затем четыре раза промойте ледяным T50-BSA/PPI.
- Разведите AF647-конъюгированное антифосфотирозиновое антитело (см. Таблицу материалов) в ледяном T50-BSA/PPI и инкубируйте на матрице в течение 1 ч.<бр/>
заметка: В настоящем протоколе для идентификации фосфорилированной популяции EGFR-GFP используется пан-анти-pTyr (PY99)-AF647 IgG. Использование антител с прямой мечкой устраняет необходимость во вторичных антителах, увеличивая возможности мечения и улучшая согласованность результатов. Флуоресцентно меченные антитела могут быть получены из коммерческих источников. Если антитела не доступны на рынке, они могут быть помечены по индивидуальному заказу с использованием стандартных методов биоконъюгации, а также доступны коммерческие наборы для биоконъюгации. Каждая партия флуоресцентно меченых антител должна быть протестирована на оптимальные условия мечения с помощью SiMPull для измерения кривой дозы и определения точки насыщения.
- Шесть раз постирайте ледяным T50-BSA в общей сложности 6-8 минут.
- Дважды постирайте ледяным 1x PBS.
- Инкубируйте матрицу с 4% раствором PFA/0,1% GA в течение 10 минут, чтобы предотвратить диссоциацию антител.
- Промойте дважды в течение 5 минут каждый с 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4/PBS для инактивации фиксаторов.
заметка: Для экспериментов с использованием более чем одного антитела (например, обнаружение нескольких сайтов фосфотирозина) повторите шаги 2.5-2.9.
3. Получение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Получение изображений одной молекулы выполняется с использованием объектива TIRF 150x и разделителя изображений, который захватывает каждый спектральный канал в определенном квадранте камеры emCCD (см. Таблицу материалов). Калибровочные изображения сначала получаются для регистрации каналов и калибровки усиления камеры с помощью наноструктурированной сетки выравнивания каналов (наносетки), которая содержит 20 x 20 массивов отверстий 200 ± 50 нм на расстоянии внутри отверстия 3 ± 1 мкм (общий размер ~60 мкм × 60 мкм).
- Выполните регистрацию канала, выполнив следующие действия.
заметка: Точная регистрация каналов нужна для правильного расчета колокализации излучателей. Этот шаг имеет решающее значение.
- Очистите масляную мишень и нанесите каплю масла на мишень. Поместите наносетку на сцену для визуализации. Используя проходящий белый свет, сфокусируйтесь на узоре сетки.
заметка: Изображения с наносеткой получаются с помощью проходящего света, который проходит через наносетку и регистрируется во всех спектральных каналах. В качестве альтернативы можно использовать мультифлуоресцентные шарики, которые излучают флуоресценцию, обнаруженную в каждом канале. Получение изображений должно быть оптимизировано в соответствии с конфигурацией каждого микроскопа.
- Получите серию из 20 изображений сетки. Убедитесь, что пиксели не перенасыщены. Сохраните ряд изображений как "Реперный".
- Расфокусируйте наносетку, чтобы создать узор Airy. Получение серии из 20 изображений для калибровки коэффициента усиления. Сохраните изображение как "Gain".
- Получите серию из 20 изображений для смещения камеры, блокируя попадание всего света на камеру. Сохраните изображение в поле "Фон".
- Получение изображений SiMPull.
заметка: Перед получением изображения матрицы покровных крышек замените решение Tris на T50-BSA и уравновесьте решетку в соответствии с RT.
- Очистите масляную мишень и нанесите на нее дополнительное масло. Закрепите защитное стекло на предметном столике микроскопа.
- Оптимизируйте мощность возбуждения каждого флуорофора, угол TIRF и время интеграции камеры. Цель состоит в том, чтобы достичь наивысшего соотношения сигнал/шум при минимизации фотообесцвечивания образца. Запишите мощность лазера для обеспечения согласованности в будущих измерениях.
заметка: В настоящем исследовании использовалось время экспозиции 300 мс для дальнего красного канала и 1 с для зеленого канала. Лазер с длиной волны 642 нм использовался при мощности лазера около 500 μВт, в то время как лазер с длиной волны 488 нм использовался при мощности 860 μВт, измеренной до трубной линзы.
- Получение изображений для каждого образца. Сначала визуализируйте дальний красный канал, а затем флуорофор с нижней длиной волны, чтобы уменьшить фотообесцвечивание. Из-за небольшого объема, используемого для каждого образца, проверяйте уровень буфера каждые 30-45 минут и пополняйте его по мере необходимости.