$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Планарные липидные бислои
- Плазменная очистка слайдов
заметка: Плазменная очистка удаляет органические загрязнения и повышает гидрофильность стекла, обеспечивая эффективную адсорбцию липидов. Следующие шаги могут измениться или потребовать оптимизации в зависимости от используемого плазменного очистителя и стеклянных покровных стекол.
- Продуйте плазменный очиститель в течение 5 минут кислородом, чтобы удалить воздух из трубопроводов и камеры. Это необходимо для того, чтобы при работе плазменного очистителя в линиях и камере в основном присутствовал кислород, что обеспечивает более однородные двухслойные препараты.
- Во время продувки направляйте инертный газ, такой как N2 или Ar, на предметные стекла микрокрышки для удаления пыли и твердых частиц.
необязательный: Покровные стекла можно мыть, распыляя с каждой стороны 100% изопропанол с последующей водой. Повторите промывку изопропанолом и водой 3 раза, а затем высушите струей N2.
- Разложите сухие покровные стекла в керамическую колыбель. Разместите подставку в задней части плазменной камеры так, чтобы покровные стекла были параллельны длинному краю камеры (это удерживает их на месте во время плазменной очистки). Запустите плазменный очиститель в течение 15 минут с кислородом на максимальной мощности.
- Подготовка камеры
заметка: Описанный здесь метод использует самодельные камеры из пластиковых ПЦР-пробирок для поддержания реакционных объемов, но могут подойти и другие материалы с низкой адгезией, такие как силиконовые лунки.
- С помощью бритвенного лезвия или ножниц отрежьте колпачок чуть ниже матовой части ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл (Рисунок 1).
- Покрасьте край ПЦР-пробирки УФ-активированным клеем, избегая внутренней части пробирки. Аккуратно поместите ПЦР-пробирку клеем в центр очищенного плазмой покровного стекла.
заметка: Чтобы избежать попадания клея внутрь камеры, используйте минимальное количество клея для получения уплотнения, и своевременно обработайте ультрафиолетом, не ударяя и не тревожа камеру.
- Поместите камеру под длинноволновое ультрафиолетовое излучение на 5-7 минут, чтобы клей застыл.
- Формирование бислоя
заметка: На этом этапе следует использовать монодисперсные внедорожники для эффективного формирования бислоя. В таблице 1 приведены рецепты для всех буферов, используемых при формировании бислоя, включая исходные и конечные буферные концентрации.
- Добавьте 40 мкл поддерживаемого липидного бислойного буфера (SLBB: 300 мМ KCl, 20 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ MgCl2; Таблица 1), 10 мкл 5 мМ внедорожников и 1 мкл 100 мМ CaCl2 в скважину. Осторожно встряхивайте камеры из стороны в сторону, чтобы нарушить работу внедорожников, а затем инкубируйте при температуре 37 °C в течение 20 мин.<бр/>
заметка: Чтобы ограничить испарение, инкубируйте в закрытой чашке Петри с влажной салфеткой.
- Вымывание излишков липидов
заметка: Этот шаг удаляет лишние внедорожники и действует как этап замены буфера. Очень важно не соскребать бислой наконечником пипетки во время мытья; Если стекло подвергается воздействию, септины и многие другие белки будут необратимо связываться, снижая эффективную концентрацию белка.
- После инкубации промойте бислой 6 раз 150 μл SLBB, каждый раз передавая пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать, избегая образования пузырьков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 150 мкл непосредственно в 50 мкл буфера и SUV, которые уже присутствуют в реакционной лунке, в общей сложности 200 мкл.
- Когда вы будете готовы начать инкубацию с септинами или другим белком по выбору, промойте бислой 6x 150 μл реакционного буфера (RXN: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4, 1,4 мг/мл BSA, 0,14% метилцеллюлозы, 1 мМ BME).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов сделайте реакционный буфер свежим и будьте очень осторожны при перемешивании в реакционном колодце, чтобы избежать образования пузырьков.
- На последнем этапе промывки удалите 125 μL реакционного буфера, оставив 75 μL в лунке. Добавьте 25 мкл септина, разведенного в буфере для хранения септина (SSB: 300 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4, 1 мМ BME) в желаемой концентрации и получите изображение с помощью микроскопии TIRF.
заметка: При первом проведении этого анализа или включении нового липидного состава рекомендуется обеспечить свободную диффундацию липидов на поверхности с помощью восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Хотя скорость восстановления будет разной для разных липидных составов и по своей природе ниже, чем для отдельно стоящих систем, липиды не должны быть неподвижными.
Таблица 1: Компоненты буфера для получения поддерживаемого липидного бислоя и реакции. Показаны объемы исходных растворов, которые входят в буферы, и конечные концентрации каждого компонента. SLB и PRB можно хранить при комнатной температуре и повторно использовать между экспериментами. Реакционный буфер и SSB изготавливаются свежими для каждого эксперимента.
| Поддерживаемый липидный двухслойный буфер (SLBB) |
| запас | том | Конечная концентрация |
| 2 м KCl | 1,5 мл | 300 мМ |
| 1 м ГЕПЕС | 200 μл | 20 мМ |
| 500 мМ MgCl2 | 20 μл | 1 мМ |
| Вода | 8 мл | |
| Буфер предварительной реакции (PRB) |
| запас | том | Конечная концентрация |
| 2 м KCl | 166 мкл | 33,3 мМ |
| 1 м ГЕПЕС | 500 мкл | 50 мМ |
| Вода | 9,33 мл | |
| Буфер реакции |
| запас | том | Конечная концентрация |
| 2 м KCl | 166 мкл | 33,3 мМ |
| 1 м ГЕПЕС | 300 μл | 50 мМ |
| 10 мг/мл BSA | 1,39 мл | 1,39 мг/мл |
| 1% метилцеллюлозы | 1,39 мл | 0,0014 |
| Вода | До 10 мл | |
| БМИ | 0,7 мкл | 1 мМ |
| Буфер для хранения септина (SSB) |
| запас | том | Конечная концентрация |
| 2 м KCl | 1,5 мл | 300 мМ |
| 1 м ГЕПЕС | 500 мкл | 50 мМ |
| Вода | До 10 мл | |
| БМИ | 0,7 мкл | 1 мМ |
