Анализ бислоя липидов со сферической опорой: метод наблюдения за сборкой септина на микросферах

Аннотация

Источник: Curtis, B. N. et al., Восстановление сборки септина на мембранах для изучения биофизических свойств и функций. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео описывается техника изучения сборки белка септина на микросферах, покрытых липидными бислоями. Этот метод помогает понять зависящие от кривизны сборки белка на изогнутых поверхностях.

Протокол

1. Сферические липидные бислои

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются микросферы кремнезема, взвешенные в сверхчистой воде с плотностью 10%. Для любой работы над кинетическими параметрами сборки белка важно строго контролировать общую площадь поверхности мембраны между экспериментами и кривизной. В таблице 1 приведены скорректированные объемы гранул и буфера для поддержания 5^мм2 общей площади поверхности мембраны.

1. Формирование бислоя
   заметка: Что касается планарных бислоев, то для надежного формирования бислоев важно иметь высококачественные SUV. В таблице 1 перечислены объемы валиков из раствора плотности 10% и их соответствующие объемы SLBB, которые используются для получения конечной площади поверхности 5^мм2 для диапазона диаметров валиков.
   1. Микросферы кремнезема (также называемые бусинами) имеют тенденцию оседать и слипаться; чтобы смешать шарики и разбить любые кластеры, сделайте бутылку вихревой в течение 15 секунд, затем очистите ванну ультразвуком в течение 1 минуты и снова сделайте вихревой в течение 15 секунд.
   2. Смешайте соответствующий объем гранул (Таблица 1) с соответствующим объемом SLBB и 10 мкл 5 мМ внедорожников в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 мл.
   3. Раскачивайте шарико-липидную смесь из конца в конец в течение 1 часа при комнатной температуре. Убедитесь, что эта инкубация проводится на ротаторе, чтобы предотвратить осаждение.
2. Подготовка камер на полиэтиленовых покровных стеклах
   заметка: Что касается планарных бислоев, то для поддержания реакционных объемов используются самодельные камеры из пластиковых ПЦР-пробирок, но не хуже могут подойти и другие материалы с низкой адгезией, например, силиконовые лунки.
   1. Пока бусины раскачиваются, разморозьте полиэтиленовый покровный стекло при комнатной температуре. Отрежьте ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл и приклейте ее к покровному стеколу, как описано. Для слайдов размером 24 мм x 50 мм на одном слайде может поместиться до 10 камер.
      заметка: В этом протоколе используются заранее подготовленные покровные стекла из полиэтиленового стекла размером 24 мм x 50 мм. Вкратце, стеклянные покровные стекла тщательно очищаются с помощью ультразвука в ацетоне, метаноле и 3 М KOH. Затем покровные стекла функционализируют n-2-аминоэтил-3-аминопропилтриметоксисиланом и ковалентно связывают с mPEG сукцинимидилвалератом. Готовые полиэтиленовые покровные стекла хранятся в вакуумной упаковке при температуре −80 °C. Несмотря на то, что здесь предлагаются покровные стекла из ПЭГилированного стекла, эффективными могут быть другие средства пассивации, такие как методы BSA или поли-L-лизина.
3. Смывание излишков липидов
   заметка: Этот шаг предназначен для удаления лишних внедорожников и выполнения замены буфера. В общей сложности шарики промываются 4 раза буфером для предварительной реакции (PRB: 33,3 мМ KCl, 50 мМ HEPES, pH 7,4). В таблице 2 приведены скорости отжима в RCF для диапазона диаметров валиков.
   1. Прядите бусины при назначенной РЧС в течение 30 с (Таблица 2). Если вы используете бусины разных размеров, держите бусины в напряжении, пока не придет время их стирать.
      заметка: Не стоит осаждать более крупные бусины в том же отжине, что и более мелкие бусины с меньшей скоростью осаждения бусин, чтобы сэкономить время. Это может привести к тому, что бусины будут прилипать друг к другу и нарушить целостность бислоя.
   2. После первого отжима удалите 50 мкл надосадочной жидкости и добавьте 200 мкл PRB. После второго и третьего вращений уберите 200 μL и добавьте 200 μL PRB. После четвертого отжима удалите 200 μL и добавьте 220 μL PRB. Энергично пипетка для каждой промывки.<бр/> заметка: Итоговый объем ресуспензии отличается от смывок. Не засоряйте бусины после инкубации с липидами, так как это может оставить пробелы в бислоях. Чтобы избежать осаждения при работе с другими размерами шариков или настройке других частей анализа, поместите смеси шариков обратно на вращатель «конец за концом».
4. Подготовка реакции
   1. Если вы проводите соревновательный тест с несколькими размерами шариков, сделайте смесь 1:1, смешав равные объемы шариков каждого размера вместе. Затем смешайте 29 μL желаемой смеси шариков (или одного шарика) с 721 μL буфера RXN.
      заметка: Важно тщательно перемешивать бусины на каждом этапе с помощью пипетки, чтобы избежать плотных скоплений бусин; Это приведет к более равномерному распределению валиков и точной общей площади поверхности.
   2. Смешайте в лунки 75 μл разведенных шариков и 25 μл разведенного в SSB белка.
      заметка: Авторы обычно визуализируют дрожжевые септиновые комплексы при концентрации от 1 до 50 нМ.
   3. При измерении септинов в равновесном состоянии инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем визуализируйте с помощью либо близкой к TIRF, либо конфокальной микроскопии.
      заметка: Эта реакция предназначена для сохранения общей площади поверхности мембраны реакции на уровне 5^мм2 и получения конечного состояния реакции 100 мМ KCl, 50 мМ HEPES, 1 мг/мл BSA, 0,1% метилцеллюлозы и 1 мМ BME.

Таблица 1: Нормализованные объемы микросфер. Чтобы поддерживать равную площадь поверхности каждого размера шарика и поддерживать постоянную общую площадь поверхности мембраны между экспериментами, были рассчитаны объемы для каждого размера шарика и буфера, который нормализовал общую площадь поверхности.

См. См. См. См.

Диаметр борта (мкм)	Объем хорошо перемешанных шариков (μл)	Объем буфера SLB (μл)	Объем внедорожников (мкл)
6.46	8.94	Статья 61.1	10
5.06	7	63	10
3.17	4.39	65,6	10
0,96	1.33	68,7	10
0,54	0,75	69,3	10
0,31	0,43	Серия 69,6	10

Таблица 2: Скорости осаждения для микросфер различного диаметра. Для каждого диаметра гранул были использованы указанные минимальные скорости осаждения, чтобы гранулировать шарики для вымывания несвязанных липосом

См. См. См. См.

Диаметр борта (мкм)	Скорость осаждения (RCF)
0,31	4.5
0,54	4.5
0,96	2.3
3.17	0,8
5.06	0,3

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,2 мл ПЦР-пробирки с плоской крышкой, натуральные	Уотсон	137-211С(ЕХ)
Пробирки с низкой адгезией 0,5 мл	США Сайентифик	1405-2600
Бета-меркаптоэтанол (BME)	Сигма-Олдрич	М6250-100МЛ
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	А4612-25Г
Покровное стекло для изготовления PEGилированных покровных стекол	Термо Сайентиал	No 152450 (Английский	Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Защитное стекло 24x50 #1.5
ДОПК	Avanti Polar Lipids	850375
Яйцо Liss Rhodamine PE	Avanti Polar Lipids	810146
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Х3375-1КГ
Метилцеллюлоза 4000cp	Сигма-Олдрич	М052-100Г
Мини-центрифуга
Нефункционализированные микросферы диоксида кремния	Бэнгс Лабораториз, Инк.	Зависит от размера: SS0200*-SS0500*	Диоксид кремния в водной суспензии
Оптический клей	Норланд Торлабс	NOA 68	Гибкий клей для стекла или пластика
Хлористый калий	ВВР	0395-1кг
Ультразвуковая ванна	Брэнсон	1510R-MT	Ультразвуковой очиститель Bransonic. 50-60 Гц. Выходная мощность: 70 Вт
Соя ПИ	Avanti Polar Lipids	840044
Настольная центрифуга	Эппендорф	No 22331
УФ-лампа	Спектролайн	ENF-260C	115 Вольт, 60 Гц, 0,20 А

гг. )