$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Культура эпителиальных клеток роговицы человека
- Выращивайте иммортализированный HCEC в покрытых коллагеном колбах площадью 75 см² с 20 мл модифицированной смеси F-12 (DMEM/F12) от Dulbecco, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C с 5% CO2,
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхивание не требуется.
- Меняйте носители каждые 2−3 дня.
2. Подготовка клеток к тестированию
- После того как клетки почти сливаются, удаляют питательные среды.
- Добавьте 4−6 мл раствора для диссоциации клеток в каждую колбу объемом 75 см². Инкубируйте клетки при 37 °C до тех пор, пока клетки не отделятся (примерно 20−30 мин), периодически проверяя под микроскопом.
- Добавьте 2−6 мл DMEM/F12, содержащего 10% FBS, в каждую колбу площадью 75 см².
- Переложите содержимое колбы в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
- Центрифугируйте клетки при давлении 450−500 x g в течение 5 мин. Пипетируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в предварительно подогретых средах.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Рассчитайте объем среды, содержащей в общей сложности 1 x 105 ячеек.
- Добавьте 1 x 105 клеток в каждую лунку 48-луночного планшета, покрытого коллагеном-1. Добавьте в лунку достаточное количество среды таким образом, чтобы конечный объем среды в лунке составил 0,5 мл культуры DMEM/F12 с 10% FBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат искусственной слезы может вызвать цитотоксичность, которая может быть измерена снижением метаболической активности ГЭКК. Согласованность данных зависит от добавления одинакового количества HCEC в каждую лунку при посеве. Рекомендуемая концентрация культуры для 48 луночных планшетов составляет 1 x 105. Поскольку клетки млекопитающих могут оседать в центрифужной пробирке после ресуспензии, рекомендуется часто ресуспендировать клетки путем перемешивания во время засеивания планшетов клетками, чтобы клеточная суспензия равномерно распределила HCEC.
- Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 24 ч.
3. Нет протокола высыхания
- Порядок действий
- После 24-часовой инкубации извлеките питательную среду из планшета.
- Немедленно обработайте 150 мкл исследуемой рецептуры и раствором для контроля среды.
- Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 30 минут.
- Удалите исследуемые растворы из клеток.
- Добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя для проверки метаболической активности. Инкубируйте клетки еще 4 ч при 37 °C и 5%CO2.
- После 4-часового инкубационного периода удалите по 100 мкл раствора метаболического красителя из каждой лунки и поместите каждые 100 мкл в лунку 96-луночного планшета.
- Измерьте флуоресценцию каждой лунки с помощью считывателя флуоресцентных пластин (Таблица материалов). Установите длину волны возбуждения на 540 нм и длину волны излучения на 590 нм.
- Протокол высыхания отсутствует (процедура восстановления)
- Повторите шаги 3.1.1−3.1.4.
- Добавьте по 0,5 мл среды DMEM/F12 в каждую лунку.
- Инкубируйте один набор культур в течение 18 ч при 37 °C и 5%CO2.
- Удалите среду и добавьте 0,5 мл 10% раствора метаболического красителя. Повторите шаги 3.1.6 и 3.1.7.