$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Синтез SPIO-MtbsAb
- Синтезировать SPIO-конъюгированный 2,2'-(этилендиокси)бисетиламин (ЭДБЭ) с использованием ранее описанных методов.
- Синтезировать SPIO-EDBE-янтарный ангидрид (SA).
- Размешать щелочной раствор (5 М NaOH; 10 мл)) SPIO-EDBE и SA (1 г; 10 мкмоль) при комнатной температуре в течение 24 ч.
- Диализуйте раствор 20 заменами по 2 л дистиллированной воды с помощью молекулярно-пористой мембранной трубки (отсечка 12 000-14 000 МВт). 6 ч для каждой замены.
- Наконец, добавьте 100 мкл SPIO-EDBE-SA (4 мг/мл Fe) к 400 мкл 4,5 мг/мл поверхностного антитела Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) для синтеза SPIO-MtbsAb с использованием 1-гидроксибензотриазола и (бензотриазола-1-илокси) трипирролидинофосфония гексафторфосфата в качестве катализаторов и перемешайте раствор при комнатной температуре в течение 24 ч.
- Наконец, отделите растворы от несвязанного антитела с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
- Загрузите реакционную смесь (5 мл) на столб диаметром 2,5 см × 33 см и элюируйте с помощью буфера с фосфатно-солевым буфером (PBS). Подтвердите комплекс Ab–наночастицы (т.е. нанозонд) с помощью набора для анализа белка бицинхониловой кислоты.
2. Наблюдение за морфологией частиц и измерение уровня релаксации
- Изучите средний размер, морфологию и распределение частиц по размерам с помощью просвечивающего электронного микроскопа при напряжении 100 кВ.
- Отлите композитную дисперсию на медной сетке толщиной 200 меш и высушите на воздухе при комнатной температуре перед загрузкой в микроскоп.
- Измерьте значения времени релаксации (T1 и T2) нанозондов с помощью ЯМР-релаксометра на частотах 20 МГц и 37,0 °C ± 0,1 °C.
- Калибруйте релаксометр перед каждым измерением.
- Запишите значения r1 и r2 из восьми точек данных, полученных с помощью инверсии-восстановления и последовательности импульсов Карра-Перселла-Мейбума-Гилла, соответственно, чтобы определить релаксацию r1 и r2.
3. Визуализация клеток
- Культивирование моноцитов человека THP-1 в RPMI 1640 с 10% фетальной бычьей сывороткой, 50 мкг/мл гентамицина сульфата, 100 ед/мл пенициллина натрия G, 100 мкг стрептомицина сульфата и 0,25 мкг/мл фунгизона в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C.
- Инкубировать нанозонды SPIO-MtbsAb (2 мМ) со 106 колониеобразующими единицами (КОЕ) Mycobacterium bovis BCG, предварительно инкубированными с 1 × 107 активированными моноцитами в микроцентрифужных пробирках (1 мл) в 5% CO2-инкубаторе при 37 °C в течение 1 ч.
- Центрифугируйте пробирки при плотности 200 х г и выбросьте надосадочную жидкость. Растворите гранулы в среде (200 μл).
- Сканирование образцов с использованием быстрой последовательности градиентных эхо-импульсов (время повторения (TR) = 500; Эхо-время (TE) = 20; Угол поворота = 10°) с помощью МРТ 3,0 Тл для определения специфичности и чувствительности нанозонда.
4. Прививка БЦЖ (Bacillus Calmette-Guérin)
- Восстановите лиофилизированную вакцину или бактериальный запас в среде Саутона, а затем разбавьте сырье физиологическим раствором до тех пор, пока он не будет должным образом диспергирован, как описано выше.
- Инокулируют живой аттенуированный штамм M. bovis BCG, полученный от ADIMMUNE (Тайбэй, Тайвань) (штамм Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) в объеме 0,1 мл/мышь (т.е. 107 КОЕ) внутрикожно в левую или правую спинную кожу лопатки мышей, как описано ранее. Вводите мышам физиологический раствор в качестве отрицательного контроля. Ежедневно наблюдайте за животными после прививки БЦЖ.
- Умершить животных через 1 месяц после инокуляции бактерий с использованием углекислой эвтаназии. Соберите ткань из места внутрикожного посева. Зафиксируйте ткань в 10% формалине и заделайте ее в парафин для серийных срезов при давлении 5-10 мкм. Окрашивание срезов тканей гематоксилином/эозином и красителями Циля-Нильсена для кислотоустойчивых бактерий и берлинским синим для трехвалентного железа.
5. МРТ in vivo
- Вводите мышам подкожно кетамин (80 мг/кг массы тела) и ксилазин (12 мг/кг массы тела) для анестезии животных.
- Введите зонды SPIO-TbsAb (2 нмоль/200 мкл) в хвостовые вены мышей. МР-изображения мышей до и сразу после введения зонда, а затем каждые 5 мин в течение 30 мин для получения Т2-взвешенных быстрых спин-эхо-изображений (TR = 3000; TE = 90; поле зрения = 8).
- Количественный анализ всех МР-изображений с использованием интенсивности сигнала (SI) — измерения определенных областей интереса в сопоставимых местах центра гранулемы Mtb и мышцы спины, прилегающей к гранулематозной области.
- Расчет относительных усилений сигнала с помощью измерения СИ до (SIpre; контроль) и через 0–3 ч после (SIpost) введения контрастных веществ с использованием формулы
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
где SIpre — это SI поражения на предварительно усиленном сканировании, а SIpost — это SI поражения на постусиленном сканировании.