Получение антител из культуры периодического разрастания трансфицированных клеток млекопитающих

Аннотация

Источник: Elgundi, Z. et al., Производство и очистка терапевтического антитела в лабораторных масштабах.J. Vis. Exp.(2017)

Видео демонстрирует метод получения терапевтических антител с использованием стабильно трансфицированных клеток млекопитающих. Добавки триптона стимулируют деление клеток, что приводит к избыточному росту и способствует более высокому выходу антител. Среду, содержащую антитела, собирают, фильтруют и хранят для дальнейшего использования.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола необходимо использовать подходящий вектор экспрессии млекопитающих. Здесь используется одна конструкция, содержащая две кассеты экспрессии (т.е. экспрессия тяжелой и легкой цепи управляется отдельными промоторами). Тяжелые и легкие цепи трастузумаба ранее клонировались в переносчик. Этот вектор был подарком от Эндрю Бивила, полученным через некоммерческое хранилище плазмид

.

1. Восстановление и масштабирование векторной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Векторная ДНК была получена в виде мягкой агаровой стаб-культуры в штамме Escherichia coli XL-1 Blue; вектор обладает устойчивостью к гигромицину.

1. Вставьте стерильный инокуляционный кол или петлю в мягкий агар посевной культуры, затем прорежьте агаровую пластину Luria Bertani (LB), приготовленную с гигромицином 75 мкг/мл для изолированных колоний. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 18-24 часов.
2. Введите одну колонию в 5 мл отвара Terrific (TB), содержащего 75 мкг/мл гигромицина. Инкубировать культуру при 37 °C в течение 18-24 часов с встряхиванием при 225 об/мин.
3. Используйте ночную культуру для получения глицеринового запаса векторной ДНК, аккуратно смешав 800 мкл культуры с 200 мкл 80% глицерина в криовиале и заморозьте при -80 °C.
   1. Добавьте 100 мкл ночного посева к 100 мл ТБ, содержащему 75 мкг/мл гигромицина, в колбе с перегородкой (т.е. разведение 1/1000). Инкубировать культуру при 37 °C в течение 18-24 часов при встряхивании со скоростью 225 об/мин.
4. После ночного культивирования извлеките и очистите дезоксирибозную нуклеиновую кислоту (ДНК) в соответствии с инструкциями производителя для набора для препарата миди/макси, за следующим исключением: на заключительном этапе элюируйте или ресуспендируйте ДНК водой (pH 7,0-8,5).
5. Проверьте концентрацию и чистоту ДНК по показаниям абсорбции при 260 и 280 нм, затем сохраните ДНК при температуре -20 °С. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно (настоятельно рекомендуется): Секвенирование ДНК с использованием векторно-специфичных праймеров для подтверждения идентичности.

2. Стабильная трансфекция клеток HEK-293

1. Выращивание и поддержание клеток HEK-293 (суспензионных клеток) в соответствии со стандартными протоколами в бессывороточных средах с добавлением 0,1% неионогенного поверхностно-активного вещества в колбах Эрленмейера. Поддерживайте в концентрации 2 x 10⁵ клеток/мл и субкультуру каждый четвертый день. Культивирование клеток при 37 °C с 5% углекислым газом (CO₂) и вращением 120 об/мин.
   Примечание: Клетки должны находиться в культуре не менее 4 дней и не более 4 недель до трансфекции. Для этой процедуры также можно использовать клетки HEK-293, выращенные в виде монослоев в сывороткосодержащих средах.
2. За день до трансфекции засейте клетки HEK-293 в концентрации 3 x 10⁵ клеток/мл в лунки 12-луночного планшета в 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS). В день трансфекции убедитесь, что клетки достигли 80-90% конфлюенции
3. Разведите ДНК и полиэтиленимин (ПЭИ) отдельно в трансфекционной среде, а затем смешайте их вместе.
   1. Развести 1,25 мкг векторной ДНК на лунку (15 мкг на 12 лунок) в 300 мкл трансфекционной среды. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
   2. Развести 2,5 мкл 1 мг/мл раствора ПЭИ (30 мкл на 12 лунок, т.е. соотношение ДНК и ПЭИ 1:2) в 300 мкл трансфекционной среды. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
   3. Добавьте разбавленную ДНК к разбавленному PEI, аккуратно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
4. Добавьте по 50 мкл смеси ДНК/ПЭИ по каплям в каждую лунку планшета. Осторожно покачайте пластину, чтобы распределить трансфекционную смесь, затем поместите пластину при температуре 37 °C, 5%_CO2 на 24 часа.
5. Добавьте 50 мкг/мл гигромицина В на лунку и верните планшет до 37 °С, 5%_СО2 на 10 дней.<бр/> Примечание: К 10-му дню нетрансфицированные клетки умирают и отделяются от поверхности пластины, в то время как стабильно трансфицированные клетки становятся жизнеспособными и прикрепляются к пластине.
6. Замените среду в лунках на 1/4 объема бессывороточной среды и 3/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 0,5 мл бессывороточной среды + 1,5 мл DMEM = 7,5% конечной концентрации сыворотки) и инкубируйте в течение 4 дней.
7. Замените среду в лунках на 1/2 объема бессывороточной среды и 1/2 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 1 мл бессывороточной среды + 1 мл DMEM = 5% конечной концентрации сыворотки) и инкубируйте в течение 4 дней.
8. Замените среду в лунках на 3/4 объемной бессывороточной среды и 1/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 1,5 мл бессывороточной среды + 0,5 мл DMEM = 2,5% конечной концентрации сыворотки) и инкубируйте в течение 4 дней.
9. Замените среду в лунках 2 мл бессывороточной среды с добавлением 0,1% неионогенного поверхностно-активного вещества (т.е. 0% конечной концентрации сыворотки) и инкубируйте в течение 4 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте селективное давление гигромицина B 50 мкг/мл на клетки во время бессывороточной адаптации. Клетки, адаптированные к бессывороточным средам, отделяются от поверхности лунок и могут группироваться во взвешенном состоянии. Обратитесь к шагу 2.1 для условий культивирования с дополнительной добавкой гигромицина В в дозе 50 мкг/мл.
10. С помощью пипетки аккуратно перемешайте суспензионные культуры в 12-луночном планшете и ячейках пула в отдельную пробирку.
    1. С помощью гемоцитометра перечислите объединенные клетки и семена в 30 мл бессывороточной среды в колбе Эрленмейера со скоростью 2 x 10⁵ клеток/мл. Культивируйте клетки при 37 °C с 5% CO₂ и вращением 120 об/мин. Субкультура и расширяется с каждым четвертым днем.
11. Продолжайте увеличивать размер культуры до необходимой плотности клеток для получения 10 флаконов по 1 х 10 7 клеток/флакон для криоконсервации в жидком азоте. Заморозьте клетки в бессывороточной среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кондиционированные среды, содержащие антитела, могут быть собраны в каждой субкультуре для подтверждения выработки белка или использованы для оптимизации условий очистки. Для сбора кондиционированной среды и поддержания клеток для субкультуры культуру центрифугируют при 300 x g в течение 5 мин, затем фильтруют-стерилизуют надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм. Отфильтрованный надосадочный продукт можно хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 недель или при температуре -20 °C при более длительном хранении.

3. Крупномасштабное производство антител из культуры периодического зарастания

ПРИМЕЧАНИЕ: Производство антител можно продолжить, начиная с шага 2.11, где существующие клетки расширяются до требуемой плотности клеток в зависимости от объема культуры зарастания партии, который необходимо установить. В противном случае клетки, которые были разморожены в результате криоконсервации, начинают на этой стадии после расширения до соответствующей плотности и объема. Для оптимизации выработки антител можно использовать различные питательные добавки; Использование триптона для увеличения выхода антител продемонстрировано в этом протоколе.

1. Затравочные клетки в концентрации 2 x 10⁵ клеток/мл в 100 мл бессывороточной среды в двух колбах Эрленмейера (для сравнения выходов антител из культур без добавок и культур с добавлением питательных веществ). Культивировать при 37 °C, 5%_CO2 и 120 об/мин.
2. Через 24 часа добавьте триптон до конечной концентрации 0,5% к культуре, обогащенной питательными веществами. Выровняйте объем необогащенной культуры с помощью среды, не содержащей сыворотки.
3. Начиная с 8-го дня, ежедневно проводите подсчет клеток культур с помощью гемоцитометра для контроля жизнеспособности клеток. Собирайте надосадочную жидкость культуры, когда жизнеспособность клеток составляет менее 80%.
   1. Соберите надосадочную жидкость путем центрифугирования культур при давлении 3000 x g в течение 15 мин, затем отфильтруйте и стерилизуйте надосадочную жидкость (содержащую антитела) через фильтр 0,22 мкм. Надосадочную жидкость хранить при температуре 4 °C (кратковременно) или заморозить при температуре -20 °C (долго).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Векторная серия pFUSE	Н/Д	ИнвивоГен	Гены тяжелых и легких антител экспрессируются в отдельных векторах, требующих котрансфекции.
Векторная серия mAbXpress	Н/Д	ACYTE Biotech Pty Ltd.	Гены тяжелых и легких антител экспрессируются в отдельных векторах, требующих котрансфекции. См.: Jones, M. L. et al. Метод быстрого, независимого от лигирования переформатирования рекомбинантных моноклональных антител. J Иммунологические методы. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
Вектор pVITRO1	Н/Д	Н/Д	Гены тяжелых и легких антител управляются отдельным промотором в одном векторе. См.: Dodev, T. S. et al. Набор инструментов для быстрого клонирования и экспрессии рекомбинантных антител. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
Векторная серия GS	Н/Д	Лонза	Мультицистронный вектор с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта.
Мультицистронный вектор серии 1	Н/Д	Н/Д	Мультицистронный вектор с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта. См.: Li, J. et al. Сравнительное исследование различных векторных дизайнов экспрессии рекомбинантных антител IgG у млекопитающих. J Иммунологические методы. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Мультицистронный вектор серии 2	Н/Д	Н/Д	Мультицистронный вектор с тяжелыми и легкими генами антител, коэкспрессируемыми и транслируемыми в виде одиночного транскрипта. См.: Ho, S. C. et al. IRES-опосредованные трицизтронные векторы для усиления генерации высокомоноклональных антител, экспрессирующих клеточные линии CHO. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-трастузумаб-IgG1/κ	No 61883	Адджен	Экспрессионный вектор млекопитающих, содержащий гены антител к трастузумабу с геном устойчивости к гигромицину; pVITRO1-Трастузумаб-IgG1/κ, был подарком Эндрю Бивила.
Гигро Агар из Fast-Media	FAS-Hg-S	Исследования Jomar Life	Используется для приготовления малосолевого LB агара, содержащего 75 мкг/мл гигромицина.
Быстродействующие Hygro TB	FAS-HG-L	Исследования Jomar Life	Используется для приготовления бульона с низким содержанием соли при туберкулезе, содержащего 75 мкг/мл гигромицина.
Глицерин, BioXtra, ≥99%	Г6279	Сигма-Олдрич	Готовим до 80% водой и автоклавом. Хранить при комнатной температуре.
Jestar 2.0/LFU Набор для плазмиды макси	G221020	Астральный научный	Plasmid Maxi Prep Kit; элюируйте или ресуспендируйте ДНК в воде (pH 7,0-8,5).
Ячейки FreeStyle 293-F	Р790-07	Технологии Life	Клеточная линия HEK-293 адаптирована к культивированию суспензии в бессывороточных средах.
FreeStyle 293 Экспрессия Медиум	12338-018 (Английский)	Технологии Life	Бессывороточная среда специально разработана для поддержания клеточной линии 293-F и высокой экспрессии белка.
Коллифор П188	К4894	Сигма-Олдрич	Неионогенное поверхностно-активное вещество; плуроновое F-68; готовить до 10% в воде и фильтровать-стерилизовать с помощью фильтра 0,22 мкм. Хранить при температуре 4°С.
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы	11995-065 (Английский)	Технологии Life
Термоинактивированная сыворотка плода крупного рогатого скота	10082-147	Технологии Life
Полиэтиленимин, линейный, МВт 25 000	No 23966	Polysciences, Inc.	Приготовьте до 1 мг/мл в воде. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью 1 М HCl (раствор становится прозрачным) и простерилизуйте фильтром с помощью фильтра 0,22 μм. Хранить при температуре -80°C до использования.
OptiPro SFM	12309-050	Технологии Life	Бессывороточная среда с формулой Transfection
Раствор гигромицина В	АНТ-ХГ-1	Исследования Jomar Life
Диметилсульфоксид (ДМСО)	AJA2225	Thermo Fisher Scientific
Триптон (казеиновый пептон)	LP0042B	Thermo Fisher Scientific	Приготовьте до 20% PBS и отфильтруйте-стерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм. Хранить при температуре 4°С.
Система BLItz	45-5000	fortéBIO	Прибор, используемый для измерений биослойной интерферометрии (BLI).