Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Сбор свежих фекальных гранул
- Подготовьте стерильные бумажные полотенца, щипцы с тупым концом и конические пробирки объемом 50 мл.
- Поместите несколько бумажных полотенец и щипцов в отдельные пакеты для автоклава и автоклавируйте их при температуре 180 °C в сухом тепле на 30 мин. Также используйте стерильные конические трубки. Взвесьте конические трубки и запишите их вес на трубках.
- Включите шкаф биобезопасности в комнате для животных.
- Возьмите автоклавную чистую клетку для мыши без подстилки и поместите ее в шкаф биобезопасности. Снимите крышку и решетку для продуктов и поместите их внутрь шкафа.
- Положите несколько стерильных бумажных полотенец на дно клетки и поставьте металлическую решетку обратно на нее.
- Определите доноров фекалий соответствующего возраста и поместите клетку для мышей в шкаф биобезопасности. Откройте клетку и аккуратно возьмите мышь-донора (C57BL/6J) за хвост и положите ее на металлическую стойку в верхней части чистой клетки.
- Поместите крышку клетки на верхнюю часть решетки и подождите, пока животное (животные) испражнится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посадите на стойку одновременно несколько мышиных однопометников.
- Соберите фекальные гранулы и поместите их в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл. Объединяйте гранулы по половому признаку. Не смешивайте фекальные гранулы, собранные у самцов и самок.
- Еще раз утяжелите трубку и рассчитайте вес фекальных гранул.
2. Приготовление фекальной суспензии
- Приготовьте стерильный раствор (10% глицерина в обычном физрастворе).
- Добавьте 10 мл 10% глицерина/физиологического раствора в коническую трубку на каждый грамм фекальных гранул.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости увеличьте объем раствора до 20 мл. В этом исследовании также использовался 1 мл раствора на каждую гранулу (5-10 мг).
- Гомогенизируйте смесь на низкой скорости с помощью настольного гомогенизатора или блендера внутри вытяжного шкафа для ресуспендирования кала (3 X 30 с).
- Процедите каловую взвесь через 2 слоя стерильной ватной марли (10,2 см х 10,2 см). Временно храните фильтрат в холодильнике до 6 часов или упакуйте его в стерильные криогенные флаконы и храните в морозильной камере при температуре -80 °C.
- Тщательно очистите гомогенизатор или блендер в соответствии со стандартной процедурой.
3. Введение фекальной суспензии через пероральный зонд
- Разморозьте замороженную фекальную взвесь на льду, если используете замороженные образцы. Перемешайте размороженную фекальную взвесь путем вортексинга.
- Переложите свежую или размороженную фекальную суспензию в шприцы объемом 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая мышь получит в общей сложности 200 мкл фекальной суспензии, а каждая мышь IL-10-/- в контрольной группе получит 200 мкл 10% глицерина/нормального физиологического раствора.
- Взвесьте мышей и выберите правильный размер иглы для зонда и максимальный объем дозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мышей с массой тела от 20 до 25 граммов используйте изогнутую иглу для зонда весом 20 г 3,81 см с шариком 2,25 мм. Пожалуйста, обратитесь к gavageneedle.com для получения дополнительной информации.
- Проверьте иглу зондажа, измерив длину от кончика носа мыши до мечевидного отростка (дна грудины). Наполните шприц 10% глицерином/физиологическим раствором или фекальной суспензией и удалите пузырьки воздуха внутри шприца и иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если длина иглы превышает длину, нанесите отметку на стержень иглы/трубку на уровне носа. Не вводите иглу/трубку через животное за пределами этой точки, чтобы предотвратить перфорацию желудка.
- Поместите одну клетку для мыши в шкаф биобезопасности, снимите пластиковую крышку клетки и оставьте металлическую стойку на месте.
- Возьмите одну мышь за хвост и положите ее на металлическую стойку. Держите мышь за хвост одной рукой и используйте большой и средний пальцы другой руки, чтобы удерживать животное, захватывая кожу на плечах. Таким образом, передние лапы вытягиваются в сторону, что не позволит передним ступням выталкивать иглу наружу. Осторожно вытяните голову животного назад и удерживайте голову на месте одной рукой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Практикуйтесь в обращении с мышью до тех пор, пока экспериментатор не будет полностью уверен в себе, прежде чем приступать к эксперименту.
- Поместите иглу для зонда в верхнюю часть языка внутрь рта. Аккуратно продвигайтесь вдоль верхнего нёба, пока игла не достигнет пищевода. Плавно проведите иглой одним движением. Не нажимайте на иглу с усилием, если ощущается сопротивление. Выньте иглу и повторите попытку.
- После того, как игла будет правильно размещена и проверена, медленно введите материал, надавливая на шприц, прикрепленный к иглу. Не вращайте иглу и не проталкивайте ее вперед, так как это может привести к разрыву пищевода. После дозирования аккуратно вытяните иглу наружу.
- Верните мышь в домашнюю клетку. Наблюдайте за животным в течение 5-10 минут, обращая внимание на признаки затрудненного дыхания или дистресса. Повторите наблюдение за мышами через 12-24 ч после ТФМ.
