1. Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
- Культуру фибробластов человека в DMEM дополняют 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в 6-луночных планшетах.
- Прежде чем начать перепрограммирование фибробластов, покройте 6-лунки Матригелем и инкубируйте не менее часа при комнатной температуре. При 80% конфлюенции удалите среду из культур фибробластов и промойте один раз 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Добавьте достаточное количество 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы покрыть всю чашку, и инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут.
- После того, как клетки выйдут из лунок, добавьте в два раза больше DMEM с 10% FBS по сравнению с трипсином, чтобы погасить переваривание трипсина. Осторожно проводите пипетку по клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разрушить клетки. Посчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра.
- Перенесите 7 x 105 клеток в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клеточную суспензию при плотности 200 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в растворе для электропорации. Электропорировать фибробласты в соответствии с инструкциями производителя. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл электропориционного буфера и добавьте по 1 мкг каждого эписомального вектора. Электропоратные ячейки с настройками 1 650 В, 10 мс и 3 временных импульса.
- Перенесите суспензию клеток в модифицированную среду Dulbecco Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% FBS и планшет 5 x 104 клетки на лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5%CO2.
- Через 48 часов удалите среду из трансфицированных культур фибробластов и замените средой mTeSR. Заменяйте питательные среды ежедневно до тех пор, пока колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) не будут готовы к выделению. Колонии iPSC можно наблюдать через 28-35 дней.
- Когда все будет готово к выделению, механически разрежьте колонию iPSC и повторно засейте в среде mTeSR 10 мкМ ингибитором Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) (Y-27632) на 6-луночный планшет, покрытый покрытием Matrigel. Заменяйте питательную среду ежедневно.
2. Нейронная индукция и поддержание человеческих NPC
- Когда конфлюенция культур iPSC составляет около 20%, удалите среду mTeSR и замените ее средой нейронной индукции. Пополняют средство каждый второй день.
- Через 7 дней удалите среду нейронной индукции и замените ее на человеческую среду для поддержания NPC. Пополняют среду каждые вторые сутки до 7 дней до пассирования культур.
- Перед пассированием культур обмазать тарелки/колбы Матригелем при комнатной температуре не менее часа.
- Удалите среду из сливающихся культур человеческих NPC и промойте один раз 1x PBS, затем отсасывайте PBS.
- Добавьте достаточное количество раствора для отделения клеток, чтобы покрыть все лунки, затем инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C.
- Убедитесь, что все ячейки отсоединены. Добавьте в лунки/колбы в два раза больше DMEM/F-12 (модифицированная смесь Dulbecco's Eagle Medium/Nutrient Mix F-12), чем раствор для отделения клеток.
- Перелейте клетки, содержащие DMEM/F-12, в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 200 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл поддерживающей среды для NPC человека. Осторожно проводите пипетку по клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы разрушить клетки.
- Поместите треть всех клеток в культуральные лунки/колбы, покрытые Матригелем, и долейте достаточное количество среды с добавлением 10 μM Y-27632. Инкубировать питательные сосуды при 37 °C и 5%CO2.
- Разделяйте культуры 1:3 каждые 3-4 дня и пополняйте среду через день. Поддерживайте высокую плотность человеческих NPC-культур, чтобы предотвратить дифференцировку.
3. Дифференциация человеческих NPC в нейроны в кокультурах
- Добавьте лентивирусный вектор Synapsin1-tdTomato в культуру NPC человека до начала дифференцировки в нейроны. Подготовьте сокультуры астроцитов и корковых нейронов за день до дифференциации человеческих NPC.
- Промойте культуры человеческих NPC один раз 1x PBS и добавьте достаточное количество раствора для отделения клеток, чтобы покрыть все лунки/колбы, затем инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C.
- Убедитесь, что все ячейки отсоединены. Добавьте в лунки/колбы в два раза больше DMEM/F-12, чем раствор для отслоения клеток. Переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в среде для дифференцировки нейронов объемом 5 мл. Осторожно суспензируйте клетки пипетками вверх и вниз, чтобы разбить клеточную гранулу на отдельные клетки. Посчитайте количество одиночных клеток с помощью гемоцитометра.
- Тщательно аспирируйте среду из культур астроцитов/кортикальных нейронов. Пластинчатые человеческие NPC в концентрации 5 x 103 клеток/см2 в 500 мкл среды для дифференцировки нейронов с добавлением 10 мкМ Y-27632 на каждую 24-лунку. Осторожно добавьте в каждую лунку среду, содержащую человеческих NPC, чтобы не нарушить работу астроцитов и корковых нейронов.
- Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5%CO2. Заменяйте половину среды свежей средой каждые два-три дня в течение не менее 28 дней.
