Визуализация кальция в отдельных нейронах, регулирующих яйцекладку у Caenorhabditis elegans

Аннотация

Источник: Ravi, B. et al., Ratiometric Calcium Imaging of Individual in Behaving Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует технику визуализации кальция в отдельных нейронах поведения Caenorhabditis elegans с использованием генетически закодированных флуоресцентных репортерных белков. В нем описаны шаги, связанные с визуализацией движения червей и измерением коэффициентов флуоресценции репортеров от нейронов для корреляции внутриклеточных уровней кальция с активностью нейронов и поведенческими изменениями во время откладывания яиц.

Протокол

1. Штаммы, питательные среды и верх животных

1. Выращивайте червей C. elegans при 20 °C на стандартных 60-мм агаровых пластинах Nematode Growth Medium (NGM), засеянных бактериальной пищей OP50 E. coli.
2. Подготовьте две плазмиды для каждого интересующего нас промотора, специфичного для каждой клетки: одну, управляющую экспрессию GCaMP5 для регистрации внутриклеточного^Ca2+, и вторую, управляющую экспрессию mCherry для обеспечения ратиометрической количественной оценки изменений флуоресценции GCaMP5 и упрощения поиска и измерения объектов.
   заметка: Ратиометрическая визуализация GCaMP5:mCherry корректирует колебания флуоресценции GCaMP5, которые возникают в результате изменений фокуса и движений животных, а не фактические изменения внутриклеточного Ca2⁺.
3. Вводите плазмиды, экспрессирующие GCaMP5 и mCherry, вместе с плазмидой видимого маркера спасения pL15EK в гонады мутантных животных LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X и извлекайте животных, экспрессирующих GCaMP5 и mCherry без Muv lin-15(+), из трансгена с высоким уровнем копий. Используйте мутантный фон lite-1, чтобы уменьшить поведение избегания синего света.
4. Интегрируйте трансгены в хромосомы для снижения мозаицизма и упрощения генерации сложных мутантных штаммов.
   заметка: Описанный здесь штамм LX2004 содержит интегрированный высококопийный трансген, экспрессирующий GCaMP5 и mCherry в HSN от промотора nlp-3 (см. Таблицу материалов). Было обнаружено, что промотор nlp-3 стимулирует сильную экспрессию в HSN поздних L4 и взрослых животных, не вызывая значительных дефектов в развитии HSN или поведении при откладывании яиц по сравнению с другими протестированными промоторами (например, tph-1, egl-6 и unc-86). Этот штамм и другие, которые экспрессируют GCaMP5 и mCherry в моторных нейронах вентрального мозга (VC), мышцах вульвы и нейроэндокринных клетках uv1, доступны в Центре генетики Caenorhabditis, и были описаны детали их строения.
5. Нанесите бактериальный корм OP50 с засеянной пластины NGM на дно пика платинового червя и используйте его для переноса ~ 20 животных позднего L4 LX2004, экспрессирующих GCaMP5 и mCherry в HSN, из промотора nlp-3. Убедитесь, что развивающаяся вульва отображается в стереомикроскоп в виде четкого темного пятна, окруженного белым полумесяцем. Инкубировать животных при температуре 20 °C в течение 24-40 часов.
6. После инкубации нанесите OP50 на пикер и перенесите ~ 3 червя в незасеянную тарелку NGM, оставив небольшое количество пищи для кормления червей во время визуализации. Обеспечьте достаточное количество пищи, так как слишком малое количество бактериальной пищи побудит червей отойти от центра тарелки, в то время как слишком большое количество пищи усилит фоновую флуоресценцию и вызовет гипоксию.
7. С помощью плоского закругленного шпателя отрежьте кусок размером ~ 20 мм x 20 мм от пластины, несущей червей, и перенесите кусок лицевой стороной вниз на центр чистого покровного стекла размером 24 мм x 60 мм #1.5 (Рисунок 1). Начните нанесение с одной стороны, чтобы пузырьки не застряли под покровным стеклом и не помешали визуализации. Нанесите покровное стекло #1 размером 22 мм x 22 мм на верхнюю часть куска, чтобы уменьшить прилипание и испарение.

2. Настройка оборудования и контрольно-измерительных приборов

1. Поместите стадийных трансгенных червей на предметное столико инвертированного микроскопа с объективом ≥ 0,7 числовой апертуры Plan-Apochromat 20x, моторизованным XY-столиком, управляемым с помощью джойстика, разделителем изображения и флуоресцентными фильтрами для одновременного возбуждения и излучения GCaMP5 и mCherry, камерами для флуоресцентной и инфракрасной визуализации в светлом поле, а также триггерной системой освещения на светодиодах (LED) (рис. 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Светоделитель 80/20 посылает 80% сигнала изображения на флуоресцентную камеру и 20% на светлопольную камеру. Можно также использовать вертикальный микроскоп, но в этом случае кусок NGM следует поместить между предметным стеклом и большим покровным стеклом.
   1. Используйте бинокулярные окуляры, чтобы выбрать червя для визуализации. Когда животное выбрано, сдвиньте инфракрасный фильтр на место над конденсатором.
2. Триггеры транзисторно-транзисторной логики (TTL)
   1. Подключите коаксиальные кабели от каждой из трех выходных линий запуска TTL на флуоресцентной камере. Подключите первый выход к BNC входу #3 системы светодиодной подсветки.
   2. Подключите второй выход к адаптеру BNC «банан» с помощью зеленого и коричневого проводов от 8-контактного разъема GPIO, идущего к входу GPIO #3 (контакт 4) и заземлению (контакт 5) инфракрасной камеры соответственно.
   3. Подключите третий выход к адаптеру BNC «банан» с помощью соединительных проводов, идущих к цифровому входу #8 и заземлению в цифровом устройстве сбора данных (рис. 2B).
3. Цифровое устройство сбора данных (DAQ)
   1. Подключите плату микроконтроллера сбора данных (см. Таблицу материалов) к ПК с помощью USB-кабеля. Обновите прошивку с помощью стандартного протокола Firmata (см. Таблицу материалов) и настройте USB-порт для обмена данными на скорости 57600 бод.
4. Светодиоды
   1. Запустите программное обеспечение LED Controller (см. Таблицу материалов). Переключите режим запуска с «Непрерывный» на «Стробированный» и выберите канал запуска «3» для светодиодов 470 и 590 нм.
   2. Включите и введите мощность светодиода для каждого светодиода (например, установите светодиод 470 нм на 20%, а светодиод 590 нм на 40%).
5. Запустите скрипт связи с последовательным этапом 'XY-stage-final' в Bonsai (см. Таблицу материалов). Нажмите на серый узел «CsvWriter» и выберите папку для сохранения записанной информации о этапах X и Y (рисунок 3). Нажмите на зеленую стрелку на панели инструментов, чтобы инициализировать DAQ.
   заметка: Сценарий начнет записывать положение сцены X и Y, когда флуоресцентная камера подаст сигнал TTL. Этот скрипт выводит четыре столбца данных: номер кадра, позиция X (μm), позиция Y (μm) и интервал между кадрами (кадрами).
6. В программном обеспечении для записи с инфракрасной камеры (см. Таблицу материалов) в разделе «Пользовательские видеорежимы» выберите «Режим 1» (2 x 2 binning; 1 024 x 1 024 пикселей) и «Pixel Format Raw 8». В разделе «Триггер / Стробоскоп» установите входную линию триггера (GPIO) на «3», полярность на «Высокая» и «Режим» на «14». Включите параметр "Включить", чтобы остановить захват кадров до тех пор, пока не будет получен сигнал запуска TTL.
   1. Оставив это окно открытым, нажмите красную кнопку «Запись» на главной панели инструментов просмотра камеры. Выберите папку для сохранения последовательностей изображений. Выберите режим записи «Буферизованный» и сохраните «Изображения» в формате JPEG. Нажмите «Начать запись», чтобы инициализировать захват.
7. Флуоресцентная камера и разветвитель изображения
   заметка: Флуоресцентные каналы GCaMP5 и mCherry должны быть собраны одновременно, чтобы обеспечить надлежащую регистрацию изображения для ратиометрического количественного анализа. Разделитель изображения позволяет получать двухканальную информацию о флуоресценции GCaMP5 и mCherry на одном сенсоре.
   1. На вкладке «Захват» программного обеспечения для получения изображений (см. Таблицу материалов) установите время экспозиции на 10 мс, биннинг на 4x, а глубину изображения на 16 бит. Выберите центрированный подмассив камер размером 512 пикселей в ширину и 256 пикселей в высоту. Нажмите «Показать параметры выходного триггера» и установите все триггеры в положение «Положительный».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система сбора данных иногда может пропускать срабатывания TTL, если их время составляет 10 мс или меньше.
   2. Убедитесь, что для параметров «Триггер 1» и «Триггер 2» установлено значение «Экспозиция», а для параметра «Триггер 3» установлено значение «Программируемый» с периодом 25 мс. На вкладке «Последовательность» выберите «Таймлапс» с задержкой в 50 мс, чтобы собрать изображения с частотой 20 Гц. Выберите «Сохранить во временном буфере».
8. Усиление ФЭУ и интенсивность лазера при трехканальной конфокальной визуализации
   1. Установите усиление ФЭУ таким образом, чтобы фоновая флуоресценция была на уровне чуть выше минимального (уровень черного). Увеличивайте мощность лазера на 561 нм (зеленый) до тех пор, пока на пресинаптическом конце в канале mCherry не будет наблюдаться один насыщенный 12-битный или 16-битный пиксель.
   2. Отрегулируйте интенсивность лазера с длиной волны 488 нм (синий) так, чтобы флуоресценция GCaMP5 была видна только на пресинаптическом конце над фоном. Этот низкий уровень предотвращает насыщение пикселей GCaMP5 при увеличении флуоресценции в ответ на сильные переходные процессы Ca²⁺. Откройте конфокальное отверстие до упора, чтобы максимально захватить свет.

3. Ратиометрическая визуализация Ca²⁺ и запись поведения

1. На вкладке «Последовательность» в программном обеспечении для регистрации флуоресценции нажмите «Начать», чтобы начать запись. Отслеживайте червя с помощью джойстика, удерживая интересующую клетку (клетки) и синапсы в фокусе и в центре поля зрения (FOV). Нажмите кнопку «Статистика» в окне гистограммы, чтобы отобразить статистику по каждому каналу в пикселях.
2. Отрегулируйте мощность светодиода, чтобы обеспечить максимальную однопиксельную флуоресценцию mCherry на пресинаптическом конце ≥ 8 000 отсчетов (~ 4 000 фотоэлектронов), что дает ~ 12-битный динамический диапазон над фоном (~ 100 фотоэлектронов). Сигналы GCaMP5 на пресинаптическом конце во время покоя (низкий)^Ca2+ должен составлять около ~ 2,500 отсчетов - только видимый над фоном.
3. Записывайте до тех пор, пока не будет достигнуто одно активное состояние яйцекладки; как правило, это происходит каждые 20-30 минут у червей дикого типа. Сохраните 10-минутный поднабор (12 001 кадр), 6 000 кадров до и после первого события откладывания яиц (кадр 6 001). Обязательно сохраняйте одно и то же подмножество светлых изображений поведения червя и временных точек положения XY-стадии, иначе точная синхронизация потоков данных будет потеряна.
4. Используйте ImageJ и плагин BioFormats (см. Таблицу материалов) для преобразования последовательностей изображений в формат Image Cytometry Standard (.ics), чтобы их можно было импортировать в программное обеспечение Ratiometric Quantitation.

Результаты

Рисунок 1. Метод монтажа C. elegans для визуализации активности и поведения схемы яйцекладки с высоким разрешением.Сверху, окончательное крепление сбоку. Снизу, последнее крепление, если смотреть через нижнюю часть большого покровного стекла. Стрелками обозначены бактериальная пища OP50, черви C. elegans и яйца, зажатые между куском агара NGM и большим покровным сте...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C. elegans выращивание, выращивание и посадка
Штамм бактерий Escherichia coli, OP50	Генетический центр кенорхабдита	ОП50	Пища для C. elegans. Урацил ауксотроф. E. coli B. Уровень биобезопасности 1
HSN GCaMP5+mШтамм червя Cherry	Генетический центр кенорхабдита	ЛХ2004	Интегрированный трансген с использованием промотора nlp-3 для управления экспрессией GCaMP5 и mCherry в HSN. Полный генотип: vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
Мутантный штамм LITE-1(CE314), LIN-15(N765TS) для получения трансгенов	автор	ЛХ1832	Штамм для восстановления высококопийных трансгенов после микроинъекции с помощью спасательной плазмиды pL15EK lin-15(n765ts). Также несет связанную мутацию lite-1(ce314), которая снижает чувствительность к синему свету. Доступно у автора по запросу
pL15EK lin-15a/b геномная спасательная плазмида	автор	pL15EK	Спасательная плазмида для восстановления трансгенных животных после введения в LX1832 Штамм lite-1(CE314), LIN-15(N765TS) X. Доступно у автора по запросу
Плазмида pKMC299	автор	ПКМК299	Плазмида для экспрессии mCherry в HSN из промотора nlp-3. Имеет непереведенную область nlp-3 3'
Плазмида pKMC300	автор	ПКМК300	Плазмида для экспрессии GCaMP5 в HSN из промотора nlp-3. Имеет непереведенную область nlp-3 3'
Фосфат калия одноосновной	сигма	П8281	Для подготовки пластин NGM
Фосфат калия двухосновной	сигма	П5655	Для подготовки пластин NGM
Гептагидрат сульфата магния	Амреско	662	Для подготовки пластин NGM
Дигидрат хлорида кальция	Альфа Аэсар	No 12312	Для подготовки пластин NGM
пептон	Бектон Дикинсон	No 211820 (Английский	Для подготовки пластин NGM
Хлорид натрия	Амреско	241	Для подготовки пластин NGM
холестерин	Альфа Аэсар	А11470	Для подготовки пластин NGM
Агар, бактериологический тип А, ультрачистый	Аффиметрикс	No 10906	Для подготовки пластин NGM
Чашки Петри 60 мм	ВВР	No 25384-164	Для подготовки пластин NGM
24 x 60 мм микрозащитные стекла, #1.5	ВВР	48393-251	Покровное стекло, через которое просматриваются черви
22 x 22 мм микрозащитные стекла, #1	ВВР	48366-067	Покровное стекло, которое закрывает верхнюю часть куска агара
Стереомикроскоп с базой из проходящего света	Лейка	М50	Препарирующий микроскоп для поддержания, определения стадии и монтажа деформации червя
Платиновая иридиевая проволока, (80:20), 0,2 мм	АЛЬФА АЭСАР	AA39526-BW	Для переноса червей
Кальциевый микроскоп для визуализации
Антивибрационный воздушный стол	ТМС	Номер 63-544	Стол Micro-g' Lab 30" x 48" антивибрационный стол с 4" CleanTop M6 на столе 25 мм
Инвертированный составной микроскоп	Цейсс	431007-9902-000	Инвертированный микроскоп Axio Observer.Z1
Боковой порт L80/R100 (3 позиции)	Цейсс	425165-0000-000	Чтобы отвести 20% выходного сигнала на светлопольную (CMOS) камеру, 80% — на флуоресцентную (sCMOS) камеру
Откидной спинной держатель подсветки	Цейсс	423920-0000-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения
Корпус фонаря 12 В/100 Вт с коллектором	Цейсс	423000-9901-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения
Галогенная лампа 12 В/100 Вт	Цейсс	380059-1660-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения. Светодиоды белого света не излучают значительного инфракрасного света, поэтому они не позволяют получать изображения в светлом поле после инфракрасного полосового фильтра
32 мм Инфракрасный полосовой фильтр (750-790 нм) для галогенной лампы	Цейсс	447958-9000-000	БП 750-790; DMR 32 мм, для инфракрасного освещения для светлого поля и поведения
Револьверная конденсаторная револьверная с 6 фильтрами (LD 0,55 H/DIC/ph), моторизованная	Цейсс	424244-0000-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения
Конденсатор и затвор	Цейсс	423921-0000-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения
Бинокулярный окуляр с фототрубкой для инфракрасной CMOS-камеры	Цейсс	425536-0000-000	Для инфракрасной визуализации/визуализации поведения
Окуляр 10x, 23мм	Цейсс	444036-9000-000	Для локализации червя на агаровом участке
Адаптер C-Mount 2/3" с 0,63-кратным увеличением	Цейсс	426113-0000-000	Крепление для инфракрасной CMOS камеры
КМОП-камера для инфракрасного светового поля и поведения (1-дюймовый сенсор)	FLIR (ранее Point Grey Research)	GS3-U3-41C6NIR-C	Камера для светлопольной съемки
Плата хост-контроллера USB 3.0	FLIR (ранее Point Grey Research)	АСС-01-1202	Fresco FL1100, 4 порта
8 контактов, кабель GPIO длиной 1 м, круглый разъем Hirose HR25	FLIR (ранее Point Grey Research)	АСС-01-3000	Кабель для запуска TTL. Зеленый провод подключается к GPIO3 / контакту 4, а коричневый провод подключается к заземлению / контакту 5
План-Апохромат 20х/0,8 WD=0,55 М27	Цейсс	420650-9901-000	Наилучшее сочетание увеличения, числовой апертуры и рабочего расстояния
6-кубическая рефлекторная турель, моторизованная	Цейсс	424947-0000-000	Для флуоресцентной визуализации
Люминесцентный световой поезд, моторизованный	Цейсс	423607-0000-000	Для флуоресцентной визуализации
Флуоресцентный затвор	Цейсс	423625-0000-000	Для флуоресцентной визуализации
Куб двойного фильтра возбуждения и излучения GFP и mCherry (для микроскопа)	Цейсс	489062-9901-000	Набор фильтров FL 62 HE BFP+GFP+HcRed для флуоресцентной визуализации
Система светодиодной подсветки	Цейсс	423052-9501-000	Запускаемая светодиодная система Colibri.2 для флуоресцентного освещения
Светодиодный модуль GFP (470 нм)	Цейсс	423052-9052-000	Colibri.2 LED для возбуждения флуоресценции GFP
Светодиодный модуль mCherry (590 нм)	Цейсс	423052-9082-000	Colibri.2 LED для возбуждения флуоресценции mCherry
Ползунок с диафрагмой для падающего света	Цейсс	000000-1062-360 (на английском	Диафрагма полевой апертуры для ограничения светодиодного освещения полем зрения камеры
Адаптер C-Mount 1" 1.0x	Цейсс	426114-0000-000	Адаптер для разветвителя изображения и флуоресцентной камеры sCMOS
Разделитель изображений	Хамамацу	А12801-01	Gemini W-View, можно использовать и другие разделители изображения, но они могут быть не оптимизированы для большого размера сенсора камер sCMOS
Дихроичное зеркало GFP / mCherry (разделитель изображения)	Семрок	Ди02-Р594-25х36	Разделение GCaMP5 от mCherry и инфракрасных сигналов
Эмиссионный фильтр GFP (разделитель изображения)	Семрок	ФФ01-525/30-25	Захват флуоресценции GCaMP5
mCherry/ эмиссионный фильтр (разделитель изображения)	Семрок	ФФ01-647/57-25	Этот фильтр необходим для исключения инфракрасного излучения, используемого для получения изображений в светлом поле
sCMOS камера для флуоресценции (сенсор 1 дюйм)	Хамамацу	А12802-01 / К11440-22КУ	Orca FLASH 4.0 V2. В более новых моделях предусмотрена возможность раздельной настройки получения изображений на разных половинах матрицы, что позволяет получать двухканальные изображения в сочетании с разделителем изображения
Моторизованная двухкоординатная сцена	Марцхойзер	СКАН IM 130 х 100	Движение столика; разрешение этого предметного столика по оси XY составляет 0,2 мкм на шаг
Сценический контроллер XY с джойстиком	ЛЮДЛ	MAC6000, XY джойстик	Ручное отслеживание червей. MAC6000 контроллер должен быть подключен к ПК через последовательный порт (RS-232) с конфигурацией 115200 бод
Плата цифрового сбора данных (DAQ)	Ардуино	ООН	Получение TTL-триггеров от sCMOS камеры. Uno должен быть загружен стандартным пакетом Firmata, а USB-порт компьютера настроен на 57600 бод
Кабель BNC с вилкой на кабель BNC - 6 футов	Технология Hosa	ХОББ6	Разъемы BNC для запуска TTL
Позолоченный коаксиальный кабель BNC Male на SMA (8,8 дюйма)	UXCELL	6.08642Э+11	Для подключения триггерных выходов флуоресцентной камеры
Адаптер поворотной головки BNC	Хантек	RRBNCTH21	Адаптер BNC на вилку типа «банан» (4 мм)
Разъем BNC «гнездо-гнездо	Диагенг	20130530009	Адаптер BNC с гнездом на гнездо для подключения выхода BNC от камеры к разъему Banana Plug
Гибкие перемычки на макетной плате без пайки	Z&T	GK1212827	Для подключения триггерных выходов BNC к системе сбора данных Arduiono выполните следующие действия.
Высокопроизводительная рабочая станция	Л.С	Сталь Z820	Windows 7, 64 ГБ ОЗУ, процессор Dual Xeon, твердотельный диск C:, последовательный порт (RS-232), несколько слотов PCIe3 для подключения Ethernet, карты USB 3.0 и дополнительные твердотельные накопители
Твердотельный накопитель M.2	Самсунг	МЗ-V5P512BW	Высокоскоростная потоковая передача и анализ данных изображений
M.2 Адаптер твердотельного накопителя для рабочих станций	Лайком	ДТ-120	4-полосный адаптер M.2 на PCIe 3.0
Сетевая система хранения данных	Компания Synology	Сервер DS-2415+	Хранение и анализ данных визуализации
Жесткие диски	Вестерн Диджитал	WD80EFZX	RED 8 ТБ, 5400 об/мин класс SATA 6 Гб/с 128 МБ кэш 3,5 дюйма. Хранение данных образов (10 дисков + 2 резервных диска)
программное обеспечение
Регистрация флуоресценции	Хамамацу	HCImage DIA	Запись двухканальных (GCaMP5 и mCherry) последовательностей флуоресцентных изображений со скоростью 20 кадров в секунду
Приобретение Brightfield	FLIR (ранее Point Grey Research)	Захват мух	Запись последовательностей изображений в формате JPEG в светлом поле
Считыватель последовательных портов Stage	бонсай	https://bitbucket.org/horizongir/bonsai	Облегчает отслеживание глистов во время их поведения
Программное обеспечение для светодиодного контроллера	Цейсс	Тест Micro Toolbox 2011	Настройка интенсивности и триггерных входов для различных светодиодов в устройстве Colibri.2
ИзображениеJ	НИЗ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Простой просмотр последовательностей изображений и изменений форматирования для импорта в программное обеспечение Ratiometric Quantitation
превосходить	Майкрософт	2002984-001-000001	Для генерации подмножеств данных о значениях, разделенных запятыми, из Volocity для анализа MATLAB
Поиск вершины	МАТЛАБ	R2017a	Скрипт, используемый для вычисления пиковых характеристик Ratio peak feature
Ратиометрическое количественное определение	Перкин Элмер	Волатильность 6.3	Облегчает расчет ратиометрических каналов изображения, сегментацию изображений для поиска объектов и измерение соотношения найденных объектов
Сценарии
AnalyzeGCaMP_2017.м	МАТЛАБ	Среднее отношение и скрипт центроида XY	Анализирует ратиометрические выходные данные в формате .csv, объединяя объекты и положения центроидов, вычисляя изменения соотношения (ΔR/R), определяя пики и особенности пиков, а также записывая графики (с аннотированными пиками и без них) в формате постскриптума. Для импорта матричного файла скрипт будет выводить данные в три папки: analyzed, peaks и traces. «Анализируемый» вывод представляет собой матричный файл объединенных объектов с шестью столбцами (единицами): время (с), площадь (квадратные микроны), отношение, центроид X (микроны), центроид Y (микроны) и ΔR/R. Вывод «Пики» представляет собой матричный файл с временными точками найденных пиков, амплитудой (в ΔR/R), шириной пика (с), и выпуклость вершины. На выходе 'Traces' находятся постскриптумные файлы со следами кальция.
XY-этап-финал.бонсай	бонсай	Считыватель последовательных портов с запуском по протоколу TTL и позиционирования последовательного порта	Записывает положение столика X и Y (в микронах), когда подключенный Arduino получает положительный сигнал TTL от камеры sCMOS во время экспозиции кадра. Скрипт записывает файл .csv с четырьмя столбцами: номер кадра, позиция X (микроны), позиция Y (микроны) и время, прошедшее между кадрами (обычно ~50 мсек при записи со скоростью 20 кадров в секунду). Положение X и Y сцены из этого вывода (столбцы 2 и 3 соответственно) добавляются к позициям центроида X и Y из AnalyzeGCaM