Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление стандартно-искусственной спинномозговой жидкости (aCSF)
- Приготовление исходного раствора А
- Добавьте 700 мл дистиллированной воды в чистую стакан объемом 1 л перед добавлением химикатов.
- Непрерывно помешивая объем 500 мл, добавьте 136,75 г NaCl, 6,99 г KCl, 2,89 г MgSO4 и 2,83 г 2PO4.
- Добавьте еще дистиллированной воды до конечного объема 1 л. После разбавления конечная концентрация каждого соединения составляет 117 мМ NaCl, 4,69 мМ KCl, 1,2 мМMgSO4 и 1,18 мМ2PO4.
- Хранить в холодильнике при температуре 4 °C до 2 недель.
- Приготовление исходного раствора Б
- Добавьте 700 мл дистиллированной воды в чистую стакан объемом 1 л перед добавлением химикатов.
- Непрерывно помешивая объем 500 мл, добавьте 41,45 г D-глюкозы и 41,84 г NaHCO3.
- Добавьте еще дистиллированной воды до конечного объема 1 л. После разведения конечная концентрация каждого соединения составляет 11,5 мМ D-глюкозы и 24,9 мМNaHCO3.
- Хранить в холодильнике при температуре 4 °C до 2 недель.
- Перед каждым экспериментом смешайте 50 мл бульона А с 50 мл бульона В и доведите до 1 л с дистиллированной водой до получения окончательного концентрации раствора аКСФ и оставьте при РТ, непрерывно насыщая его карбогеном (смесь 95% О2 - 5% СО2) не менее 30 мин. Готовьте окончательную концентрацию аКСФ только в начале каждого эксперимента и выбросьте в конце дня.
2. Приготовление сахарозно-искусственной спинномозговой жидкости (Сахароза-aCSF)
- Приготовление исходного раствора С
- Добавьте 700 мл дистиллированной воды в чистую стакан объемом 1 л перед добавлением химикатов.
- Постоянно помешивая 500 мл дистиллированной воды, добавьте 240 г сахарозы, 6,55 г NaHCO3, 0,671 г KCl, 4,88 г MgCl2, 0,22 г CaCl2 и 0,21 г аскорбиновой кислоты.
- Добавьте еще дистиллированной воды до конечного объема 1 л. После разбавления конечная концентрация каждого соединения составляет 701,1 мМ сахарозы, 78 мМ NaHCO3, 9 мМ KCl, 24 мМ MgCl2, 1,5 мМ CaCl2 и 1,2 мМ аскорбиновой кислоты.
- Храните на складе раствор С при температуре 4 °C в течение одной недели.
- Перед каждым экспериментом смешивайте 300 мл 50 мл бульона С с 600 мл дистиллированной воды для получения раствора сахарозы-aCSF в конечной концентрации. Оставьте на RT, непрерывно насыщая его карбогеном (смесь 95%O2 - 5% CO2) не менее 30 минут.
3. Приготовление ломтиков
- Поместите в лед чистый стакан со 100 мл раствора сахарозы-aCSF, одновременно насыщая его карбогеном, и зафиксируйте pH на уровне 7,4 с помощью pH-метра, добавив при этом несколько капель 0,1 М раствора NaOH (при pH < 7,4) или 0,1 М раствора HCl (при pH > 7,4).
- Заполните режущую камеру вибратома сахарозой-aCSF и напитайте ее кислородом. Включите систему охлаждения на основе глицерина, соединенную с камерой резки, и подождите 15 минут, чтобы она остыла до 0 - 4 °C.
- Обезболивайте крыс (в возрасте от 9 до 12 лет от взрослых беременных крыс Спрэга-Доули) кетамином (70 мг/кг, внутримышечно; используя < 50 мкл конечного объема). Когда щенок спокоен, перепроверьте, отсутствует ли рефлекс щипкового хвоста.
- Обезглавливайте щенков.
- Разрежьте кожу головы в продольном направлении спереди назад с помощью лезвия скальпеля из углеродистой стали, а кожу оттяните в стороны с помощью щипцов. Разрежьте кость, покрывающую мозг, сдвиньте ножницы в сторону и полностью удалите ее, чтобы обнажить мозг.
- Затем быстро удалите мозг с помощью шпателя (первоначально помещенного под обонятельную луковицу, чтобы аккуратно вытолкнуть его из самой ростральной области в сторону наиболее каудальных областей). Осторожно вдавите мозг в охлажденную кислородом сахарозу и искусственную спинномозговую жидкость (сахарозу-aCSF).
- Сделайте парасагиттальный разрез на правом полушарии (удалив примерно одну треть полушария) и приклейте обрезанную сторону мозга на металлический диск, который будет магнитно закреплен на режущей камере виброслайсера, чтобы вырезать сагиттальные участки размером 400 мкм, содержащие черешковое ядро (PPN). Храните срезы PPN при температуре RT в течение 45 минут перед записью патч-зажима для всей клетки.
4. Записи колебаний гамма-диапазона в срезах PPN
- Приготовление внутриклеточного раствора глюконата калия (раствор с высоким содержанием К+)
- Положите в лед чистый стакан с 10 мл дистиллированной воды. При непрерывном перемешивании добавляйте: K+-глюконат, 90,68 мг фосфокреатина di Tris соли, 47,66 мг HEPES, 1,5 мг EGTA, 40,58 мг Mg2+-АТФ и 4 мг Na+2-GTP.
- Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью KOH (100 мМ в дистиллированной воде). Добавьте дистиллированную воду до конечного объема 20 мл. При необходимости отрегулируйте осмолярность сахарозой (100 мМ в дистиллированной воде) до 280 - 290 мОсм. После разведения конечная концентрация каждого соединения составляет 124 мМ K+-глюконата, 10 мМ фосфокреатина ди трис-соли, 10 мМ HEPES, 0,2 мМ EGTA, 4 мМ Mg2+-АТФ и 0,3 мМ Na+2-ГТФ.
- Аликвотировать внутриклеточные растворы в пробирках по 1 мл и заморозить при -20 °С. Использовать по одной аликвоте в день и держать при 4 °С во время экспериментов.
- Запись с помощью патч-клетка
- Поместите ломтики в погружную камеру и перфузируйте их (1,5 мл/мин) оксигенированным (95% O2 - 5% CO2) aCSF, содержащим следующие антагонисты рецепторов: селективный антагонист NMDA-рецепторов 2-амино-5-фосфоновалеровая кислота (APV, 40 μM), конкурентный антагонист AMPA/5-глутаматных рецепторов 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX, 10μM), антагонист рецепторов глицина стрихнин (STR, 10 мкМ), специфический антагонистрецептора ГАМК А габазин (GBZ, 10 мкМ) и блокатор натриевых каналов тетродотоксин (TTX, 3μM)
Заполняйте записывающие патч-пипетки (сопротивление 2-7 МОм; изготовлены из обычных, имеющихся в продаже толстостенных капилляров из боросиликатного стекла с наружным диаметром 1,0 мм и внутренним диаметром 0,6 мм) внутриклеточным раствором с высоким содержанием K+ с использованием имеющихся в продаже коммерчески доступных патч-пипеток с фильтром раствора. Вставьте пипетку в держатель усилителя. Надавите на небольшое положительное давление с помощью шприца объемом 1 мл, подключенного к держателю пипетки с помощью силиконовой трубки, подключенной к трехходовому клапану. Подключите заднюю часть держателя для дозатора к усилителю с патч-зажимом.
- Переместите записывающую пипетку с помощью механического микроманипулятора рядом с ядром PPN с помощью объектива 4X в сочетании с ближней инфракрасной дифференциальной интерференционной контрастной оптикой.
заметка: Ядро PPN может наблюдаться в срезах дорсально по отношению к верхней ножке мозжечка (SCP; наблюдается в виде толстого пучка аксонов). Записывающие пипетки располагались в PPN pars compacta, который расположен непосредственно дорсально к заднему концу цветоноса.
- Подведите записывающую пипетку к нейрону PPN во время визуализации с помощью 40-кратной линзы для погружения в воду и быстро примените отрицательное всасывание, чтобы сформировать уплотнение с клеткой.
- Используйте программное обеспечение для уплотнения зажима напряжения для контроля сопротивления пипетки во время отрицательного всасывания в соответствии с протоколом производителя.
- Когда отрицательное всасывание медленно увеличивается, а значения сопротивления, считанные патч-хомут-монитором на кончике пипетки, достигают 80 - 100 МОм, быстро изменяют потенциал удержания до -50 мВ и сбрасывают отрицательное давление. Начинайте непрерывно применять отрицательное отсасывание до тех пор, пока не будет достигнут разрыв мембраны нейрона, и электрический доступ не будет достигнут в конфигурации всей клетки.
- Если значения сопротивления доступа, измеренные программным обеспечением уплотнения с зажимом напряжения, составляют 10 МОм или выше, продолжайте применять отрицательное всасывание в меньших количествах.
- Компенсируют емкостное (т.е. медленные и быстрые переходные процессы, наблюдаемые после разрыва мембраны ячейки) и последовательное сопротивление в режиме напряжения-зажима. Переключите режим записи на текущий клещ и быстро компенсируйте значения моста (например, переместите ручку усилителя или щелкните меню автоматической компенсации с помощью компьютерной мыши).
- Непрерывный мониторинг мембранного потенциала покоя регистрируемого PPN нейрона в соответствии с протоколом производителя. Если мембранный потенциал покоя смещается в сторону деполяризующих или гиперполяризационных значений, то используйте небольшие величины постоянного тока (до 100 пА) для поддержания оптимального конечного значения -50 мВ><.
заметка: Оставляйте только нейроны PPN со стабильным мембранным потенциалом покоя (RMP) -48 мВ или более гиперполяризованным (т.е. RMP < -48 мВ).
