Использование оптической ловушки для изучения хост-Возбудитель Взаимодействие для динамических изображений Живая сотовый

Summary

Метод описан в индивидуальном порядке выбирать, манипулировать, и изображение живых патогенов при оптической ловушки связаны с вращающимся диском микроскопом. Оптической ловушки обеспечивает пространственной и временной контроль организмов и помещает их рядом с клетками хозяина. Люминесцентной микроскопии захватывает динамических межклеточных взаимодействий с минимальным возмущением к клеткам.

Abstract

Динамическая визуализация живых клеток позволяет напрямую визуализировать взаимодействия между клетками иммунной системы в реальном времени^{1, 2}; однако, отсутствие пространственного и временного контроля между фагоцитарной клеткой и микробом затрудняет целенаправленные наблюдения за начальными взаимодействиями реакции хозяина на патогены. Исторически сложилось так, что события межклеточного контакта, такие как фагоцитоз³, визуализировались путем смешивания двух типов клеток, а затем непрерывного сканирования поля зрения для поиска случайных межклеточных контактов на соответствующей стадии взаимодействия. Стохастический характер этих событий делает этот процесс утомительным, и при таком подходе трудно наблюдать ранние или мимолетные события в межклеточном контакте. Этот метод требует поиска пар клеток, которые находятся на грани контакта, и наблюдения за ними до тех пор, пока они не завершат свой контакт или не достигнут его. Чтобы устранить эти ограничения, мы используем оптический захват как неинвазивный, неразрушающий, но быстрый и эффективный метод позиционирования клеток в культуре.

Оптические ловушки, или оптические пинцеты, все чаще используются в биологических исследованиях для захвата и физического манипулирования клетками и другими микронными частицами в трех измерениях⁴. Давление излучения впервые было обнаружено и применено к оптическим пинцетным системам в 1970^{году5, 6}, а впервые было использовано для контроля биологических образцов в 1987^году7. С тех пор оптический пинцет превратился в технологию для исследования различных биологических явлений^8-13.

Мы описываем метод¹⁴, который улучшает визуализацию живых клеток путем интеграции оптической ловушки с конфокальной микроскопией вращающегося диска с контролем температуры и влажности, чтобы обеспечить тщательный пространственный и временной контроль патогенных организмов в физиологической среде для облегчения взаимодействия с клетками-хозяевами, как определено оператором. Живые патогенные организмы, такие как Candida albicans и Aspergillus fumigatus, которые могут вызывать потенциально смертельные, инвазивные инфекции у лиц с ослабленным иммунитетом^15-16 лет (например, пациенты со СПИДом, химиотерапией и трансплантацией органов), были оптически захвачены с помощью неразрушающей лазерной интенсивности и перемещены рядом с макрофагами, которые могут фагоцитозировать патоген. Высокое разрешение, проходящий свет и флуоресцентные фильмы установили возможность наблюдать ранние события фагоцитоза в живых клетках. Чтобы продемонстрировать широкую применимость в иммунологии, первичные Т-клетки также были захвачены и манипулированы для формирования синапсов с микросферами, покрытыми анти-CD3, in vivo, а также была получена покадровая визуализация образования синапсов. Благодаря методу осуществления тонкого пространственного контроля над живыми патогенами по отношению к иммунным клеткам, клеточные взаимодействия могут быть зафиксированы с помощью флуоресцентной микроскопии с минимальным воздействием на клетки и могут дать мощное представление о ранних реакциях врожденного и адаптивного иммунитета.

Protocol

1. Условия культивирования патогенных для оптического захвата

1. Расти А. fumigatus (B-5233/RGD12-8) на полутвердых сред, содержащих агар SBD (Сабуро декстрозы) при температуре 30 ° С в течение 3 дней.
2. Расти C. Albicans (SC5314) в YPD (дрожжи-пептон декстроза) культуральной жидкости, содержащей 100 мкг / мл ампициллина ночь в шейкере инкубаторе при температуре 30 ° C.

2. Подготовка патогенных для флуоресцентной маркировки

1. Урожай необходимое количество патогенов и передачи 1,5 трубки реакции мл.
2. Добавить 300 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) в реакционную трубку.
3. Разрушать ультразвуком смесь в течение 30 секунд.
4. Центрифуга при 4000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
5. Аспирируйте супернатант, в результате чего гранулы нетронутыми.
6. Повтор (2.4) и (2,5) еще два раза.
7. Ресуспендируют в 500 мкл ФСБ.

3. Маркировка патогенов с флуоресцентным красителем

1. Растворите 1 мг красителей интерес (например, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) в 100 мкл диметилформамида (DMF) (концентрация 10 мг / мл).
2. Добавить 3 мкл красителя смеси реакции мыть пробирки, содержащие болезнетворные микроорганизмы.
3. Поворот не трясите образца при 37 ° С в течение 1 часа.
4. Вымойте образца с PBS 3 раза центрифугированием при 4000 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
5. Ресуспендируют в 300 мкл PBS.

4. Сбор Т-лимфоцитов из цельной крови

1. Получить цельной крови (свежий).
2. Теплая кровь, PBS + 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), а Histopaque до комнатной температуры.
3. Добавить RosetteSep правам CD4 + Т-клеток по обогащению Коктейль в 50 мкл / мл цельной крови.
4. Поворот образца и инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
5. Развести образца с равным объемом PBS + 2% ЭТС и аккуратно перемешать.
6. Слой разведенного образца на вершине Histopaque, сводя к минимуму перемешивание
7. Центрифуга в течение 20 минут при 1200 мкг при комнатной температуре с вынул.
8. Удалить обогащенного клеток.
9. Вымойте обогащенные клетки 2x с PBS + 2% раствор FBS.
10. Lyse красных кровяных клеток в течение 2 минут с красными буфера ячейки лизирующего крови
11. Добавьте 10 мл ФСБ + 2% ЭТС и центрифуги лизированных эритроцитов при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут
12. Аспирируйте супернатант, стараясь не мешать гранул
13. Ресуспендируют в средствах массовой информации IMDM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки

5. Подготовка RAW 264,7 макрофагов в камеру слайдов

1. Подготовка DMEM (среда Дульбекко изменение Орла), чтобы содержать 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, и 1% L-глутамина.
2. Теплый СМИ, трипсин и PBS в теплой ванне до 37 ° C.
3. Промыть пластины 2x с PBS
4. Аспирируйте PBS между каждой стирки.
5. Добавьте 5 мл трипсина к пластине для покрытия поверхности (10 см планшета для культуры ткани).
6. Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° C.
7. Осторожно постучали стороне пластины отделить клетки от поверхности пластины. Будьте осторожны, чтобы не всплеск трипсина вне пластины.
8. Добавьте 5 мл или эквивалентную сумму средств массовой информации для трипсина.
9. Аспирируйте смесь в реакционную трубку.
10. Центрифуга при 1000 мкг в течение 3 минут.
11. Аспирируйте СМИ, осторожны, чтобы не мешать гранул.
12. Ресуспендируют в 10 мл среды.
13. Добавить 400 мкл средств массовой информации для каждой из палат камере слайд.
14. Добавьте 5 мкл клеточной суспензии для каждой камеры.
15. Вырасти на ночь в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO _2.

6. Добавление патогенов к образцу

1. Внесите 5-10 мкл меченых патогенных интереса (от шагов 1-3) в камеру.
2. Тщательно перемешать по pipeting вверх и вниз, стараясь не прикасаться к нижней части камеры беспокоить придерживался макрофагов.

7. Загрузка образца на вращающийся диск конфокальной микроскопии (в видео, сканирование через компоненты)

1. Включите все компоненты вращающийся диск конфокальной микроскопии.
2. Совместите микроскоп для DIC изображений.
3. Удалить камеру слайд из инкубатора.
4. Вставьте камеру скользить в специализированных стадии.
5. Удаление верхней части камеры слайд (необходимые для работы с изображениями DIC).

8. Подготовка к оптического захвата (в видео, сканирование через компоненты и как она интегрирована в микроскоп)

1. Включите затвора для оптической ловушке.
2. Включите ИК-лазера.
3. Открытие затвора (на лазер) для оптической ловушке.
4. Подтвердите затвор перед ИК лазерного закрыта путем проверки с карты ИК.

9. Выбор и манипуляции с патогеном оптической ловушки

1. Сосредоточьтесь на макрофаги на придерживался слайда.
2. Найти патогенов свободно колебались в решении смежных с макрофагами.
3. Перемещение стадии, что возбудитель находится в близости от ловушки.
4. Открытие затвора и заниматься ловушку.
5. Перемещение образца принести макрофагов в контакт с стационарных ловушкупед возбудителя.
6. Изображение с вращающимся диском конфокальной микроскопии, либо в DIC, флуоресценция, или комбинация обоих. Как правило, захват осуществляется в ДВС, и в реальном времени изображений осуществляется с помощью флуоресценции.

10. Представитель Результаты:

Для того чтобы приложить полный пространственный и временной контроль патогенов и бусин в естественных условиях и в пробирке среды, мы разработали на заказ ловчего аппарата интегрирован на вращающийся диск конфокальной микроскопии (схема приведена на рис. 1). В полную силу, при условии, лазерная 350 мВт и после связи света с различными оптическими компонентами оптической аппаратуры ловушку, ~ 80 мВт на цель TIRF, и измеряется с помощью измерителя мощности, была использована для формирования ловушку в камере.

Для того, чтобы положение объекта в камере относительно захваченного объекта, этап был перенесен, удерживая захваченный объект стационарной с захватом лазера. Этап был перенесен на медленной скорости достаточно, так что сила сопротивления на захваченных частиц не превышает максимальную силу захвата.

Отдельные популяции C. Albicans (типичный размер - ~ 5 мкм) были помечены каждого из трех цветов (AF488, AF568, AF647 и, соответствующий зеленый, синий и красный на рисунке, соответственно) для демонстрации изображения с нескольких каналов флуоресценции одновременно оптически захвата возбудителя. С одной Albicans был пойман в ловушку и переехал в квадратный узор через скопление других дрожжей, о чем свидетельствует серые стрелки, демонстрируя возможность захвата и манипулирования определенном месте одного патогена выбранного оператора даже в условиях перегруженности (рис. 2) .

Для иллюстрации дальнейших гибкости этой системы для улавливания различных морфологических форм выставлены патогенными организмами, оптический пинцет также был в состоянии держать и расположить C. Albicans частицы с pseudohyphae. C. Albicans помечены AF647 (красный) был перемещен по траектории, как это изложено белая стрелка и поместили рядом с люминесцентными GFP-LC3-RAW клетки (рис. 2, б). Дрожжей части С. Albicans был пойман в ловушку, как pseudohyphae волочились.

Мы также расположены Aspergillus fumigatus рядом с RAW ячейки макрофагов мыши с целью анализа абсолютных сроки фагоцитоза к данной линии клеток и патогенных (рис. 3А). Как только возбудитель вступает в контакт с клеткой, ловушкой выключен, и покадровой визуализации используется для наблюдения за последующие клеточных событий (рис. 3В). Оптическую ловушку был также использован для захвата первичных Т-клеток, выделенных из крови и направлены, прилегающих к бисером покрыты анти-CD3 антитела для того, чтобы Т-клеток с образованием иммунологических синапсов с борта (рис. 4), показывают, дополнительные Универсальность непосредственно ловушку и манипулировать иммунных клеток.

Рисунок 1. Обзор и схема комбинированной оптической ловушки и вращающийся диск установки конфокальной микроскопии. Инструмент макета, показывающий захвата пучка (фиолетовый), освещения пути для светлого изображения (оранжевый), флуоресценция луч возбуждения (красный), флуоресценция выбросов (зеленый), прибор с зарядовой связью (ПЗС) камеры, электронно-умножения Прибор с зарядовой связью (EM- ПЗС) камеры, дихроичных зеркал (D1 и D2), зеркала (М1 и М2), и линзы (L1, L2, L3, L4). Все остальные компоненты ловушки-конфокальной микроскопии системы помечены на рисунке.

Рисунок 2. () Флуоресцентные изображения уловленных и манипулировать C. Albicans. Ловушке флуоресцентно меченных (Alexa Fluor 488 (AF488), синий) организма в поле других флуоресцентно меченных C. Albicans (AF568, AF647 и зеленый, красный). Этап двигался в ловушке, синий частица CA как показывает серые стрелки. (B) Trapped псевдо-гиф форма C. Albicans рядом с GFP-LC3 RAW клетки. Флуоресцентно меченных psuedohyphal форме СА (красный, AF647) оптически ловушке и переехал, прилегающих к GFP-LC3 выразил RAW макрофагов. CA организме перемещается вдоль траектории на что указывает белая стрелка.

Рисунок 3. Перехват и позиционирования А. fumigatus рядом с фагоцитарной RAW клетки. (А) Светлое образы ловушке А. fumigatus, о чем свидетельствует белая стрелка, переехал и располагается по пути на что указывает красная стрелка. Ловушке патогена немного не в фокусе из-за ловушки нажатием организма немного выше фокальной плоскости. A. fumigatus перемещается, пока он находится рядом с желаемой RAW клетки. (B) Гриппценции изображений фагоцитоза А. fumigatus на RAW клетки. После ловушке возбудитель находится рядом с RAW-клетки, фагоцитоз процесс активизируется. На 30 с, оболочка RAW клетка начинает изменяться и форма чаши вокруг частицы. На 60 с, чашка полностью сформирован. С 90-х годов до 150 с, А. fumigatus охвачен, и на 180 с, частица полной мере учитывался

Рисунок 4. Перехват первичных Т-клеток с образованием синапса с анти-CD3 покрытой бисером. DIC образы первичных Т-клеточных тронут оптической ловушки для позиции возле бусинка покрыты анти-CD3 антитела. Ячейки затем формирует иммунологического синапса, которые не могут быть легко различить в изображениях.

Discussion

В этой работе мы используем оптическую ловушку, чтобы захватить патогенов с размерами от 3 мкм - 5 мкм. Хотя возбудители интерес к нашей лаборатории как правило, эти размеры, оптическая система пинцет, описанный здесь, гибкими, чтобы ловушка большой диапазон размеров. Действительно оптические ловушки, были использованы для захвата частиц, начиная от отдельных атомов в клетки около 10 мкм в диаметре. Кроме того, эта оптическая система захвата удалось уловить частицы различной формы: сферические, эллиптические, и очень уд...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
A. fumigatus			Альбино напряжения, B-5233/RGD12-8, подарок от KJ Kwon-Chung, NIH
C. Albicans			SSY50-B мутант, подарок от Элефтериос Mylonakis, MGH; SC5314 напряжения, подарок от Джеральда Финк, Уайтхед Институт
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
диметилформамиде	Сигма	D4551
Свежая кровь			Подарок от RJW Хит, MGH, HMS
Nikon инвертированного микроскопа	Nikon		Модель Ti-E
Перехват лазер, ChromaLase	Синий исследований Sky	CLAS-106-STF02-02
Лазерного возбуждения флуоресценции	Когерентный		Модель Innova 70C
Макеты для улавливания компонентов	Thorlabs	MB1224, MB1218
Оптический стол воздуха	Технические Manufacturing Corporation
Электронный затвор с педалью управления	Uniblitz		Приобретенные от Винсента Associates, Рочестер, штат Нью-Йорк
Одномодовое оптическое волокно	Оз оптики	PMJ-3S3S-1064-6
Волоконно позиционером	Thorlabs	СУП-X-5-C
Волоконно коллиматор	Оз оптики	HPUCO-23-1064-P-25AC
Объективы для телескопов	Thorlabs	AC254-150-B	Фокусное расстояние 150 мм
Перевод этапов (х, у, г)	Ньюпорт	М-461-XYZ
ИК дихроичных зеркал	Цветность	ET750-SP-2p8
Объектив (100X)	Nikon		NA = 1,49, нефть погружения, TIRF цель
Конфокальной головы	Yokogawa	ХСС-XI
Поляризатор	Nikon	MEN51941
Призмы Волластона	Nikon	MBH76190
EM-CCD камера	Hamamatsu	C9100-13
ПЗС-камера (ORCA ER)	Hamamatsu	C4742-80-12AG
Фильтры колесо	Ludl	99A353
Фильтры колесо	Саттер	LB10-NWE
Патрон покровного стекла	Lab-Tek/Nunc	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Покрытие анти-CD3
Дульбеко изменение Орла среды (DMEM)	Invitrogen / Gibco	10313
Пенициллин / стрептомицин	Invitrogen / Gibco	15140-122
L-глютамин	Invitrogen / Gibco	25030-081
Эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone)	ThermoScientific	SH30071.03