$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Изготовление гарнитур с двумя биполярными электродами (Рисунок 1)
- Отрежьте 3,5 см нержавеющей проволоки из нержавеющей стали с покрытием из политетрафторэтилена.
- Снимите около 1 мм изоляционного слоя с провода с обоих концов. Не зачищайте слишком много провода.
- Наденьте два штифта на держатель тисков нижней частью штифта с более длинной щелью вниз.
- Нанесите флюс на зачищенные концы проволоки и на верхушки контактов.
- Зачистите часть провода ровно настолько, чтобы покрыть ее.
- Добавьте минимальное количество припоя в верхнюю часть контакта, не переливая его по бокам.
- Поместите один конец зачищенных концов провода в контакт на максимальную глубину, пока припой расплавляется.
заметка: Есть боковое отверстие, через которое провод может выйти наружу – не допускайте выхода провода из штифта. Весь зачищенный провод должен оставаться в пределах контакта.
- Повторите шаги 1.6-1.7 для второго контакта, теперь уже с другими зачищенными концами провода.
- Дайте контактам постоять 30 секунд для установки, снимите их с держателя тисков, а затем потяните за них, чтобы убедиться, что соединение между проводом и контактами прочное и держится.
- Промойте булавки в холодной воде, а затем высушите.
- Проверьте проводимость между контактами 1 и 2 с помощью омметра.
- Соедините контакты на концах провода вместе, держите их параллельно и близко. Прижмите кровоостанавливатель к центру провода. Затем поверните гемостат, чтобы провод крутился вокруг себя довольно туго. Удалите гемостат.
- Зажмите щипцы на скрученной проволоке на 2 мм ниже штифтов и согните проволоку под углом 90°.
- Снова протолкните ту же проволоку на 90° назад над щипцами, создав еще один изгиб на 1 мм от первого.
- Обрежьте скрученную проволоку под углом 45° ниже сгиба на 3,5 мм маленькими острыми ножницами.
- Подготовьте два таких биполярных (двухконтактных витых) электрода для каждой гарнитуры (опционально, второй является резервным на случай проблем с электричеством с первым).
- Подготовьте один электрод сравнения, разрезав провод с припаянными с обоих концов контактами на две части (шаги 1.1-1.17, рисунок 1А).
- Обрежьте проволоку на 7 мм.
- Загните конец на 1 мм ниже кончика.
- Затем накройте согнутый кончик проволоки на 1 мм щипцами и плотно поверните проволоку вокруг щипцов, чтобы получилась небольшая петля (1 мм в диаметре).
- Согните петлю перпендикулярно прямой части проволоки, чтобы кончик проволоки снова был направлен наружу.
- Соберите два биполярных электрода и один электрод сравнения в шестиконтактную опору таким образом, чтобы биполярные электроды располагались рядом друг с другом на расстоянии 6 мм друг от друга, а электрод сравнения был помещен в среднее наружное отверстие (рис. 1B).
заметка: Альтернативный метод заключается в имплантации электродов, их цементировании на месте, а затем вставке их штифтов в пьедестал.
2. Имплантация стереотаксических электродов
- Перед операцией стерилизуйте все хирургические инструменты и узел шестиконтактного электрода путем автоклавирования. Во время операции необходимо поддерживать стерильное операционное поле, а также использовать стерильные хирургические перчатки. Стерильные простыни (например, Press n' Seal) рекомендуется закрывать животное, за исключением операционной зоны.
- Используйте 8-недельных мышей VGAT-Cre (экспрессирующих Cre рекомбиназу под контролем гена везикулярного транспортера GABA [VGAT], соответствующего возраста, как самца, так и самки) для проведения операций через 4 недели после отлучения от груди. Запишите вес животного перед операцией, чтобы можно было измерить послеоперационную потерю веса.
- Используйте сертифицированный исофурановый испаритель или систему анестезии с низким расходом, оснащенную прецизионным шприцевым насосом, встроенным цифровым испарителем и нагревательной прокладкой обратной связи.
заметка: Системы с низким потоком способны доставлять анестезию с низкой скоростью потока, пропорциональной размеру животного, либо в индукционную камеру, либо через носовой конус на стереотаксической раме (70 мл/мин, концентрация изофлурана в воздухе составляет 4% для индукции и 2% для хирургического вмешательства). Использование меньшего количества анестезии не только приносит пользу животному во время операций, но и снижает риск воздействия изофлурана на персонал лаборатории.
- Поместите животное под наркозом на подогретую подушку, нагретую до 37 °C, чтобы оно согревалось во время операции. Если вы используете температурную систему с обратной связью, вставьте слегка смазанный температурный зонд в прямую кишку животного для контроля температуры во время операции.
- Посадите животное на стереотаксическую раму, аккуратно поместив ушные планки в уши, а передние верхние зубы в резцы. Поместите носовой конус на нос для правильной доставки анестезии. Убедитесь, что голова выровнена и отцентрирована и не может быть сдвинута при легком прощупывании.
- Подкожно вводят 0,5 мл нормозола для гидратации.
- Наносите глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Контролируйте глубину анестезии по отсутствию рефлекса отмены после защемления пальца задней конечности, а затем снижайте изофлуран до 1,5%-2,0% во время операции.
- Удалите волосы в области операции и вокруг нее с помощью машинки для стрижки (бритья) или крема для депиляции и продезинфицируйте кожу с помощью трех циклов чередующегося нанесения йода и этанола, заканчивая йодом. Удалять волосы в сторону от места операции рекомендуется только в том случае, если есть средства для поддержания анестезии в этом месте. При необходимости используйте аппликаторы с ватными наконечниками, смоченными в спирте, чтобы удалить волосы из непосредственной области вокруг головы. Введите подкожно 0,05 мл местного анальгетика бупивакаина (0,25%).
- Сделайте надрез на черепе с помощью скальпеля, а затем острыми хирургическими ножницами вырежьте часть кожи, обнажив череп. Отодвигая кожу в сторону, с помощью ватной палочки очистите череп от всех мышц и подлежащих тканей, закрывающих обзор><.
заметка: Чтобы остановить случайное кровотечение, надавите на место кровотечения стерильным ватным тампоном до упора.
- Очистите череп перекисью водорода с помощью стерильных ватных тампонов, чтобы сделать швы черепа, а также брегму и лямбду видимыми.
- Тщательно просушите череп, а затем нанесите одну каплю самопротравливающего стоматологического клея с помощью его аппликатора. Внесите его в череп, подождите 60 секунд и отверждайте с помощью стоматологического ультрафиолетового излучения в течение 40 секунд. Глянцевая поверхность указывает на то, что клей был эффективно сшит с черепом.
заметка: Этот шаг имеет решающее значение для надежного крепления гарнитуры.
- Используйте сверло диаметром 0,031 дюйма (0,79 мм) для двустороннего сверления двух отверстий для заусенцев для имплантации электродов глубины гиппокампа (примерно 5 000 об/мин). Просверлите одно дополнительное отверстие для заусенца для электрода сравнения над мозжечком за лямбдой.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сверлении следите за тем, чтобы медленно опускать сверло и избегать сверления в мозг.
- Координаты электродов следующие (от брегмы в мм): электроды гиппокампа на расстоянии 3 мм сзади, 3 мм латерально и 3 мм глубиной; и мозжечковый электрод сравнения на 6 мм сзади, 0 мм латерально и 0 мм глубиной (субдуральный).
- Для повышения точности используйте стереотаксически установленную дрель, обнуляйте ось стереотаксического манипулятора X/Y при касании брегмы - это точка отсчета для координат.
- Соберите гарнитуру, вставив все электроды в шестиконтактный пьедестал, убедившись, что контакты полностью вставлены в пьедестал. Установите пьедестал в держатель электродов на стереотаксической раме (рис. 1B).
- Выровняйте электроды над соответствующими отверстиями для заусенцев. Стереотаксически имплантируйте скрученные биполярные электроды из нержавеющей стали в правый и левый гиппокамп и электрод сравнения в мозжечок, медленно опуская гарнитуру и направляя электроды в отверстия для заусенцев.
- Когда поворотный электрод гиппокампа окажется прямо над отверстием, обнулите ось Z и медленно опуститесь до -3,0 мм.
- Покройте поверхность черепа и электроды стоматологическим цементом и заполните пространство между поверхностью черепа и нижней частью пьедестала. Края кожи будут прилегать к стоматологическому цементу таким образом, чтобы никакие подлежащие ткани не оставались открытыми. Подождите, пока цемент высохнет и застынет. Затем отсоедините держатель электрода от стереотаксического рычага и снимите держатель с пьедестала.
- Введите 0,1 мл кетопрофена (1 мг/мл, подкожно [ПК]) для обезболивания и вторую дозу 0,5 мл нормозола (ПК) для гидратации и удалите животное из стереотаксической рамки.
- Поместите изотермическую прокладку, предварительно нагретую до 37 °C, внутрь пустой клетки вивария, застеленной бумажным полотенцем. Как только он полностью проснется, поместите животное в чистую клетку с подстилкой и мягким кормом, и верните его в виварий. С этого момента животные размещаются поодиночке, чтобы предотвратить пережевывание гарнитур друг друга. Бункеры из проволочных стержней не используются, чтобы избежать застревания гарнитур, а вместо этого бутылки с водой привязываются к нижней стороне крышки клетки, а чау-чау присутствует в подстилке.
- Кормите животное мягкой пищей в течение 72 часов после операции и следите за потерей веса и оценкой упитанности. Обезвоженным животным можно вводить 0,5 мл нормозола подкожно при обезвоживании (потеря веса, повышение тургора кожи, запавшие глаза). Кетопрофен можно вводить подкожно один раз в день в течение еще 2 дней после операции (соблюдайте режим обезболивания в соответствии с рекомендациями местного комитета по уходу и использованию животных [IACUC]). Дайте животным полностью восстановиться в клетках в течение 4-7 дней, прежде чем их переведут в систему регистрации электроэнцефалографии (ЭЭГ).
