В естественных условиях Изображение протокол для мониторинга первичных сенсорных аксонов следующие спинной раздавить корень описано. Процедуры использования широкого поля флуоресцентной микроскопии и thy1-YFP трансгенных мышей, и разрешить повторяющиеся изображения регенерации аксонов более 4 см в ПНС и аксонов взаимодействия с интерфейсом ЦНС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Живая съемка Спинной Аксоны Корневая после ризотомия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные сенсорные аксоны, поврежденные при травмах спинномозговых корешков, не восстанавливаются в спинном мозге, что приводит к хронической боли и необратимой потере чувствительности. Регенерации аксонов дорсального корешка (DR) в спинной мозг препятствует зона входа дорсального корешка (DREZ), представляющая собой интерфейс между ЦНС и ПНС. Наши представления о молекулярных и клеточных событиях, препятствующих регенерации в DREZ, неполны, отчасти потому, что сложные изменения, связанные с повреждением нерва, выводились на основании посмертных анализов. Динамические клеточные процессы, такие как регенерация аксонов, лучше всего изучаются с помощью методов, позволяющих фиксировать события в реальном времени при многократном наблюдении за каждым живым животным. Наша способность серийно мониторировать нейроны in vivo значительно возросла благодаря революционным инновациям в оптике и трансгенезе мышей. Несколько линий трансгенных мышей thy1-GFP, в которых подмножества нейронов генетически помечены различными флуоресцентными цветами, позволяют визуализировать отдельные нейроны in vivo1. Эти мыши широко использовались для in vivo визуализации мышц2-4 и мозга5-7 и предоставили новые сведения о физиологических механизмах, которые не могли быть разрешены с помощью статического анализа. Исследования нейронов в живом спинном мозге начались совсем недавно. Лихтман и его коллеги первыми продемонстрировали их осуществимость, отслеживая поврежденные аксоны дорсального столба (DC) с помощью широкопольной микроскопии8,9. Также была осуществлена многофотонная in vivo визуализация глубоко расположенных аксонов DC, микроглии и кровеносных сосудов10. За последние несколько лет мы стали первопроходцами в применении in vivo визуализации для мониторинга регенерации аксонов DR с использованием широкопольной микроскопии и линии мышей thy1-YFP H. Эти исследования привели нас к новой гипотезе о том, почему аксонам DR препятствует регенерация в спинном мозге11.
У мышей линии thy1-YFP (линия H) отдельные YFP+ аксоны расположены поверхностно, что позволяет одновременно отслеживать несколько аксонов. Мы обнаружили, что аксоны DR, достигающие DREZ, лучше визуализируются в поясничном отделе, чем в шейном отделе спинного мозга. В данном отчете мы описываем несколько стратегий, которые оказались полезными для обеспечения успешной долгосрочной и повторной визуализации регенерирующих аксонов DR. Они включают методы, которые позволяют избежать повторной интубации и перерывов в дыхании, минимизировать стресс, связанный с хирургическим вмешательством, и образование рубцов, а также получать стабильные изображения с высоким разрешением без фототоксичности.
Протокол
1. Микроскоп настройки и подготовки изображений
- Наши изображения созданы состоит из Leica MZ16 флуоресцентного стереомикроскопа с быстрым затвором и охлаждением ПЗС-камера управляется программой Метаморф.
- Подготовка термостатом грелку и настроить выход до 32,5 ° С для поддержания температуры тела животного во время и после операции.
- Теплый стерильной раствор Рингера или искусственных спинномозговой жидкости (ACSF) до 32,5 ° C заранее для орошения спинного мозга во время операции.
- Обезболить животное с внутрибрюшинного введения ксилазина (8 мг / кг) и кетамина (120 мг / кг) коктейль.
- Бритье верхней части спины с небольшими кусачками животных и распространение одной маленькой капле лосьон для волос удаление над бритой области с хлопком тампоны. Через несколько минут, снимите применяется лосьон с использованием 70% этилового спирта пропитанные губки марлю.
2. Ламинэктомия и хирургическое воздействие на задний корешок L5
- Место животное на нагревают (32,5 ° С), блокнот и дезинфекции кожи с 70% этанола, пропитанные тампоны.
- Под яркого освещения поля на стереомикроскопа, выполните средней линии разрез (2 - и 3-см) в коже спины. При необходимости можно использовать хлопковые тампоны, чтобы остановить кровотечение.
- Отражение спинной мускулатуры раскрыть основные поясничных позвонков.
- Expose L3-S1 сегментов спинного от правосторонней геми-ламинэктомии с использованием малых rongeurs. Частичное ламинэктомии подвергая 4-6 сегментов поясничного и крестцового спинного мозга создается путем удаления право спинной части L5 позвонков на уровне гребня подвздошной кости тазобедренного сустава (расположение L5 DRG) рострально для L2 позвонков (2 позвонков хвостового до последнего ребра). Заливать полость раствором теплой стерильной Рингера.
- Позиция животное на поддержку подушке (прокат хлопковой марле), чтобы сгладить позвоночника. Используйте опровержение крючки расширить область отображения.
- В этот момент (примерно 30 минут после первой инъекции ф анестезии, дополнения (0,5) следует вводить подкожно, чтобы держать животное полностью под наркозом. Кроме того, газ анестезией (2-4% изофлуран в кислороде 0.5L/min ) может быть использован для повторного обезболивания во время съемки сессии более чем на 1 час.
3. Ризотомия / Спинной раздавить корень
- Переключение в режим возбуждения флуоресценции для визуализации YFP помечены (+) аксонов.
- Использование кончик Sub-Q (26ga.) иглы, выполнить небольшой разрез в твердой мозговой оболочки вышележащих задний корешок L5 (DR). Неоднократно заливать раствором Рингера и чистой осторожно ватой тампоны.
- Определить места, где будет раздавлен и вставить одну сторону штраф пинцет (Дюмон # 5) subdurally.
- Закрыть пинцетом осторожно, но твердо, держа медиальной части L5 болеть за 10 секунд, а затем аккуратно освободить щипцами.
- Вымойте неоднократно с физиологическим раствором и чистой осторожно ватой тампоны.
4. Приобретение изображений и послеоперационных процедур
- Получить несколько изображений всего пострадавшего района в том числе сайт сокрушить и DREZ до и сразу после раздавить при низких и высоких увеличениях.
- Изображения приобретаются либо в качестве одного снимки или несколько потоков от 10 до 20 фреймов в пределах 30 - 40-мс время экспозиции. В фокусе изображения потом выбрали, и обзор монтаж создан позже с помощью Photoshop.
- Чтобы свести к минимуму образование рубцов, плотно применять кусок тонкой синтетической мембраны матрицы (Biobrane), а затем искусственные оболочки, в верхней части подвергаются спинного мозга. Будьте уверены, чтобы разрезать фрагменты, чтобы соответствовать именно в подвергается спинного окна кабель так, что они являются приверженцами спинного мозга.
- Закрыть мускулатуры стерильным 5-0 швов и близких средней линии разрез раны клипов.
- Inject раствор Рингера (0,3 до 0,5 мл подкожно) и администрирования Бупренорфин как послеоперационного обезболивания (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение 2 дней.
- Держите животное на грелку (34 ° -35 ° C), пока не восстановлены.
5. Повторные изображений
- Анестезию животного и удалить клипы раны и швы.
- Удалить искусственные оболочки и тонкие синтетические мембраны патчи матрицы и держать их в стерильную пробирку с раствором Рингера для дальнейшего использования.
- Осторожно удалите все накопленные шрам соединительной ткани с загнутым кончиком из Sub-Q и тонкой иглой щипцами. Заливать часто с раствором теплой Рингера.
- Повторно выставить операционного поля, в том числе сайт сокрушить и DREZ, переместите YFP + аксонов отображаемого на предыдущих сессиях, и повторите процедуры, описанные в разделе 4.
6. Представитель результаты:
Мы заметили, что, в то время как они не восстанавливаются после перерезки травмы, почти все аксоны YFP + вырос через сайттравмы на 3 дня после раздавить (рис. 1) 11. Как правило, на следующий день после разрушать, мы наблюдали умирают обратной дегенерации аксонов проксимальной культи и фрагментации / дегенерации аксонов же дистальнее измельчить, который подтвердил, что аксоны были надлежащим поврежден (например, на рисунке 1, 3-й день и 5) . Несколько дополнительных критериев, которые применяются к однозначно отличать регенерирующие аксоны из аксонов, которые были спасены или еще не оправилась от травмы. К ним относятся следующие: (1) регенерирующие аксоны показать расширение не-люминесцентные часть YFP + аксон на сокрушить сайт из-за проксимальных и дистальных дегенерации (в отличие от сужения немеченого разрыв в связи с люминесцентными цитоплазме заправки раздавить сайта если аксоны пережили травмы), (2) регенерирующие аксоны намного тоньше, менее яркие флуоресцентные, и больше, чем волнистые аксонов, которые пережили травму, (3) регенерирующим нейритов тоньше и более тускло, чем флуоресцентные вырождается флуоресцентные фрагменты аксонов, через которые они расширили; (4) в отличие от выживания или пощадил аксонов, регенерирующие аксоны останавливаться на DREZ; и (5) в отличие от выживания или пощадил аксонов, регенерирующие аксоны не проявляют перехватами Ранвье. На рисунке 1 показаны четыре поверхностных YFP + аксоны сразу после раздавить (A1; цветные стрелки). Через три дня после измельчить, все четыре аксонов расширить одного аксонов, которая растет через раздавить сайта (А2). Через пять дней после измельчить, невриты остаются стабильными, и нет дополнительного роста от этих или других проксимальных аксонов (A3).
Регенерирующим нейритов, которые пересекли раздавить сайт удлиненные через гораздо толще и ярче флуоресцентного фрагменты вырождается аксонов (т.е. endoneurial трубки), и прибыть в DREZ уже через 4 дня после раздавить (около 3 мм / 2 дня) 11. Повторная съемка этих аксонов и их советы каждые два-три дня в течение еще двух недель (рис. 2) показали, что они не росли вперед или отказаться, но оставался неподвижным. Единственное заметное изменение отек советы и валов некоторых аксонов. Эти наблюдения таким образом продемонстрировать удивительно быстро и хронической иммобилизации регенерирующие аксоны на DREZ.
Рисунок 1: Повторная съемка L5 DR + YFP аксонов в месте спинной раздавить корень в течение 5 дней. Медиальной части L5 корень был разгромлен (красная стрелка) и отображается на 0-й, 3 и 5 после давки. Области раздавить усиливается в правой панели (А1-А3).
Рисунок 2:. Повторная съемка аксонов прибыл в DREZ в течение 20 дней после L5 раздавить корень 4-й день, три аксонов (цветные стрелки) прибыл в DREZ. Кончики этих аксонов остаются в том же месте и имеют похожий внешний вид на последующих сессиях изображений на 7, 9, 13, 15 и 20. Позиции кончика аксона относительно других советов аксонов и достопримечательностей (звездочки) были использованы для определения аксон моторики между изображениями сессий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изображений DR регенерации непосредственно в живых мышей является особенно сложным, поскольку он требует существенных спинного ламинэктомии для контроля роста аксонов на большой площади следуют несколько инвазивных хирургических и обезболивающие процедуры в последующих сессиях изображений. Несколько стратегий помогли преодолеть эти проблемы. Во-первых, успешное изображений требуется снижение смертности мышей (около 25%), сводя к минимуму продолжительность анестезии и кровотечения, а также тщательный послеоперационный ух...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим д-р Алан Тесслер для комментариев и редакционных помощь. Эта работа была поддержана NIH NS062320.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| H-линия thy1 YFP (2-4 месяцев, либо секс) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Ксилазин (AnaSed инъекции, стерильный раствор) | Ллойд Laboratories, (Шенандоа, LA) | 4811 | 8 мг / кг |
| Кетамин (инъекции кетамина гидрохлорид, USP) | Hospira, Inc (Лейк-Форест, Иллинойс) | 2051 | 120 мг / кг |
| Бупренорфин (Buprenex для инъекций) (0,05 мг / кг) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA) | 7571 | |
| Малый машинок для стрижки волос животных | Остер Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Лосьон Удаление волос | Церкви & Dwight Co (Princeton, NJ) | НАИР с Детское масло | |
| Марлевые губки | Fisher Scientific, (Питтсбург, Пенсильвания) | 22-362-173 | |
| Хлопковые тампоны | Fisher Scientific, (Питтсбург, Пенсильвания) | 14-960-3-й квартал | |
| 1 мл шприцев | Becton, Диксон и компании Франклин озер, NJ) | 309602 | |
| Подкожный (Sub-Q) иглы, 26ga. | Becton, Диксон и Компания (Франклин озер, NJ) | 305115 | |
| Весна ножницы и щипцы | Инструменты изобразительных наук, (Foster City, CA) | ||
| 2,5-мм изогнутые rongeurs | Инструменты изобразительных наук, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Лактата Рингера инъекций USP | B. Braun медицинской Inc, (Ирвин, Калифорния) | BBR-L7502 | |
| Стерильный физиологический раствор | APP Pharmaceuticals, (Шаумбург, Иллинойс) | 918610 | |
| Тонкие синтетические мембраны матрицы (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Искусственные оболочки | Гор Предотвращение MVP Dura Substitute, и WL Gore Associates, (Флагстафф, Аризона) | 1MVP40 | |
| 5-0 швов шелка | Ethicon, Inc (Сомервилл, Нью-Джерси) | K-580 | |
| Рана клипы | Perfect - Ets Бруно, (Burnea, Франция) | A75 | |
| Флуоресцентные стереомикроскопа | Leica Microsystems (Wetzlar, Германия) | MZ16 | |
| ПЗС-камера | Хамамацу (Бриджуотер, Нью-Джерси) | ORCA-Rx2 | |
| Регулятор температуры | Всемирный точных приборов (Сарасота, Флорида) | ATC 1000 | |
| Метаморф программного обеспечения | Molecular Devices, (Саннивейл, Калифорния) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Ссылки
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
