Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Подготовка экспериментального решения и оборудования для записи многоэлектродных матриц
- Готовят искусственную спинномозговую жидкость (искусственная спинномозговая жидкость [aCSF]; 124 мМ NaCl, 4,4 мМ KCl, 1 мМ2PO3, 2 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 25 мМ NaHCO3 и 10 мМ глюкоза, пузырчатая с 95%O2 и 5%CO2).
- Используйте два типа преобразователей MEA: 6 x 10 планарных MEA и 8 x 8 MEA. Первый зонд охватывает область, которая включает кору, стриатум и таламус. Последний зонд охватывает только корковую область.
- Используйте 60-канальный усилитель с полосовым фильтром, установленным в диапазоне частот от 0,1 Гц до 3 кГц при усилении 1 200. Сбор данных с частотой дискретизации 10 кГц.
- Поместите два серебряных провода с покрытием AgCl внутрь камеры MEA для DCS. Используйте серебряные провода с покрытием AgCl для создания электрических полей, генерируемых изолированным стимулятором.
- Поместите вольфрамовый электрод (диаметр 127 мкм; длина 7,62 см; конический наконечник переменного тока 8° AC; сопротивление 5 МОм) для стимуляции таламуса и поместите электрод сравнения в камеру MEA. Подавайте токи вольфрамового электрода с помощью изолированного стимулятора, который управляется генератором импульсов.
2. Подготовка срезов мозга
- Используйте самцов мышей C57BL/6J в возрасте 4-8 недель. Размещение животных в помещении с кондиционером (21-23 °C; влажность 50%; цикл свет/темнота 12 часов/12 часов, свет включается в 8:00 утра) со свободным доступом к еде и воде.
- Возьмите 250 мл аликвоты aCSF, которая была приготовлена на шаге 1.1, и поместите ее в стакан, содержащий лед. В то же время подает непрерывный газ, состоящий на 95% изO2 и на 5% изCO2.
- хирургия
- Обезболивайте животное 4% изофлураном в стеклянной коробке примерно на 3 мин. Как только животное достигнет хирургической глубины анестезии (на что указывает отсутствие реакции на защемление пальцев ног), поместите его на неглубокий поднос, наполненный колотым льдом, и удалите голову с помощью ножниц.
- Обнажите череп и обрежьте оставшиеся мышцы. Далее, с помощью ронжеров, отделите дорсальную поверхность черепа от мозга. Обрежьте бока черепа с помощью ронжеров. Стерилизуйте все хирургические инструменты 75% раствором этанола.
- С помощью шпателя разрежьте обонятельные луковицы и нервные соединения вдоль вентральной поверхности мозга, и удалите мозг. После обезглавливания быстро перенесите мозг в стакан, наполненный ледяным кислородом aCSF.
- Приготовление MT-ACC Brain Slice
заметка: Подготовьте срезы, содержащие путь от машинного перевода к ACC.
- Вручную разрежьте мозговой блок двумя сагиттальными надрезами на 2,0 мм латеральнее средней линии в каждом полушарии, чтобы отобразить подкорковую анатомию. Затем сделайте два угловых надреза. Сделайте первый поперечный разрез параллельно видимому волокнистому тракту в полосатом теле
.
- Сделайте второй поперечный разрез от соединения между мозжечком и зрительной корой до средней точки между передней спайкой и зрительным трактом, которые являются вентральными и параллельными таламоцингулатному пути.
- Прикрепите мозговой блок к угловой пластине (~120°) с помощью цианоакрилатного клея и сделайте надрез чуть выше точки поворота дорожки. Разверните пластину, расплющите ее и приклейте к камерному столику вибратома.
- Сделайте медиальные срезы мозга таламус-ACC (толщиной 500 мкм), а затем погрузите их в ледяной кислород aCSF. Переложите срезы в камеру записи и держите при температуре 32 °C в условиях непрерывной перфузии (12 мл/мин) с кислородосодержащим aCSF в течение 1 часа.
3. Подготовка перфузионной камеры для записи на многоэлектродную матрицу
- Подготовка перфузионной камеры
- Поместите зонд MEA в многоканальную систему и используйте две отдельные полиэтиленовые трубки для подключения зонда к перистальтическому насосу. Используйте одну трубку для направления аКСФ в камеру MEA, а другую трубку — для вывода аКСФ из камеры. Наконец, непрерывно перфузируйте препарат теплым (29-30 °C) кислородосодержащим aCSF (8 мл/мин).
- Перенесите срез мозга в MEA. Удерживайте срез мозга на МЭА с помощью влажной ватной палочки. Осторожно переместите срез мозга, чтобы убедиться, что ACC ориентирован над электродами.
- Используйте наборы якорей для среза и прижимки, чтобы нажать на срез мозга. Этот шаг обеспечивает хорошее электрическое соединение между срезом и электродами.
4. Генерация электрических полей с помощью DCS
Примечание: Определение ориентации электрического поля было основано на направлении аксодендритической оси в ACC. Ориентация дендритных и сомовых компартментов была подтверждена с помощью окрашивания по методу Гольджи.
- Поместите электрод AgCl (определяемый как анод) проксимальнее АСС, а другой электрод (определяемый как катод) расположите дистальнее АСС. Запишите напряженность поля, создаваемую двумя ориентациями поля (параллельной и перпендикулярной аксодендритическим волокнам АСС) с помощью МЭА, и подайте токи электрических полей с помощью стимулятора.
- Зафиксируйте расстояние между электродами AgCl (около 1,5-2 см) и отрегулируйте силу тока стимулятора так, чтобы DCS находился в диапазоне от 0,5 до 2 мА.
5. Электрически индуцированные корковые синаптические реакции
Примечание: Вызывайте синаптические реакции в ACC с помощью электрической стимуляции в MT, в которой программируемый генератор электрических стимулов производит прямоугольные двухфазные импульсы тока.
- Повторите раздел 3 выше.
- Поместите вольфрамовый электрод в МТ и подайте импульсы от стимулятора в таламическую область срезов через биполярные вольфрамовые электроды.
- Используйте различные интенсивности тока, чтобы определить пороговое значение, вызывающее реакцию ACC. Здесь используется интенсивность ±150 мкА и длительность 200 мкс, которая вызвала максимальный отклик в 80% АКК в большинстве срезов.
- Переместите вольфрамовый электрод по пути таламоцингулы (от МТ к мозолистому телу) в срезе МТ-ACC, чтобы получить оптимальные профили отклика.
- Сделайте 10-20 проверок ответов ППК и используйте программное обеспечение для автоматического усреднения всех ППК, вызванных стимуляцией МТ. Результатом являются синаптические реакции в ACC, вызванные стимуляцией MT по пути MT-ACC.
6. Электрически индуцированная судорожная активность
Примечание: Судорожная активность была вызвана применением 4-аминопиридина (4-AP; 250 мкМ) и бикукулина (5 мкМ). Предыдущие исследования с контролем времени показали, что максимальные и стабильные ответы появлялись через 2-3 часа после применения препарата.
- Повторите раздел 5 выше.
- Добавьте в раствор для перфузии препараты. Используйте 4-AP (250 мкМ) и бикукуллин (5 мкМ). Равномерно перемешайте препараты и продолжайте перфузию в течение 2-3 часов.
- Чтобы облегчить судорожную активность, поддерживайте перфузионный насос на относительно высокой скорости перфузии (8 мл/мин), что также может помочь предотвратить накопление градиента pH.
- Поместите вольфрамовый электрод в МТ и проведите электрическую стимуляцию (150 мкА, длительность 200 мкс) для получения профилей отклика ACC.
- Сделайте 10-20 взмахов и усредните ответы.
- Замените перфузионный раствор свежим аКСФ, чтобы вымыть препараты. Повторите шаг 6.5.
7. Тестирование влияния DCS на вызванные корковые реакции
- Повторите разделы 3 и 4. Убедитесь, что однородные электрические поля генерируются за счет прохождения токов между двумя параллельными серебряными проволоками с покрытием AgCl, расположенными внутри камеры MEA. Если проблем нет, DCS остается в диапазоне от 0,5 до 2 мА.
- Выключите DCS и установите вольфрамовый электрод для стимуляции таламуса (±150 мкА, длительность 200 мкс). Чтобы получить максимальные синаптические ответы в АКК, сделайте 10-20 разверток и усредните ответы.
- Одновременно включите DCS (сила DCS 2 мВ/мм) и стимуляцию таламуса (350 μA, длительность 200 μсек). Оцените изменения амплитуды ответа АКК, вызванного таламической стимуляцией, во время ДКБ.
- Выключите DCS и добавьте в перфузионный раствор 4-AP (250 мкМ) и бикукуллин (5 мкМ). Затем подождите 2-3 часа. Когда лекарства воздействуют на срез мозга, он вызывает корковые судорожные реакции.
- Сделайте 10-20 разверток реакций ACC, а затем измерьте амплитуду и продолжительность вызванных электрическим током реакций коры головного мозга.
- После шага 7.5 одновременно включите DCS (2 мВ/мм DCS сила) и стимуляцию таламуса (150 μA, продолжительность 200 μсек). Оцените изменения амплитуды и продолжительности вызванных корковых судорожных реакций во время применения ДКБ.
- Замените перфузионный раствор свежим aCSF, чтобы вымыть препараты, и повторите шаги 7.2 и 7.3.
- Соберите все данные записи и сгруппируйте данные по различным условиям эксперимента. Оцените амплитуду и продолжительность реакций коры головного мозга при различных экспериментальных условиях.
