Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовка и культивирование органотипических срезов гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол позволяет производить органотипические срезы гиппокампа. В идеале не более трех животных должны быть усыплены и препарированы за один сеанс, чтобы гарантировать, что каждый шаг выполняется быстро и избежать ухудшения качества ломтиков. Используйте асептическую технику во всем.
- Перед началом протокола вскрытия убедитесь, что выполнены следующие шаги.
- Заранее приготовьте и отфильтруйте все растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Храните растворы при температуре 4 °C во время хранения и во время вскрытия мозга и подготовки разреза гиппокампа, постоянно держа контейнеры для хранения и чашки Петри на металлическом радиаторе на влажном льду.
- Автоклавируйте все металлические инструменты, кольца и бумажные салфетки.
- Убедитесь, что все инструменты и материалы, которые будут использоваться на каждом этапе протокола, готовы к использованию, заранее изложены и пропитаны 70% этанолом. Затем дайте им остыть и высохнуть.
- Усыпьте 5–7-дневного детеныша мыши C57BL/6N при вывихе шейки матки и кратковременно протрите всю поверхность кожи стерильной бумажной салфеткой, смоченной в 70% этаноле. Промокните кожу насухо и обезглавьте щенка с помощью ножниц Майо.
- Разрежьте кожу головы ножницами радужной оболочки глаза по средней линии головы, начиная с затылочной области и заканчивая возле рыла, и втяните ее в сторону.
- Вставьте кончик ножниц Ванны в большое затылочное отверстие и сделайте два небольших боковых надреза на кости вдоль поперечных пазух, затем разрежьте череп по средней линии до обонятельной луковицы и сделайте два небольших разреза перпендикулярно средней линии в этой области.
- С помощью тонко изогнутых щипцов отведите лоскуты кости латерально от средней линии. Осторожно извлеките мозг с помощью небольшого шпателя и перенесите его в чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером толщиной 90 мм><, содержащую «среду для вскрытия».
заметка: Средой для вскрытия служит сбалансированный раствор соли Гея (5 мг/мл D-глюкозы, 1% раствор антибиотика-антимикотика, 10 000 ЕД/мл пенициллина, 10 мг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл амфотерицина В).
- Удалите мозжечок и отделите полушария головного мозга по средней линии с помощью лезвия бритвы. С помощью шпателя перенесите полушария головного мозга в новую чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером толщиной 90 мм, наполненную свежей, ледяной средой для рассечения. Если в одном сеансе предполагается использовать более одного животного, повторите шаги 1.2–1.6.
- Под стереомикроскопом разрежьте лезвием бритвы обонятельную луковицу и кончик лобной коры и отделите кору головного мозга от остальной мозговой ткани с помощью щипцов с тонкими наконечниками. На этом этапе гиппокамп остается обнаженным на медиальной поверхности корковой ткани. Начиная с этого шага, используйте колпак для культуры тканей с ламинарным потоком (ультрафиолетовый стерилизованный и очищенный 70% раствором этанола).
- Нанесите ледяную среду для рассечения на плоский пластиковый рубящий диск и с помощью шпателя расположите мозговую ткань на диске таким образом, чтобы медиальная поверхность коры головного мозга была обращена вверх, а ось гиппокампа была перпендикулярна оси рубящего лезвия.
- Максимально удалите диссекционную среду из измельчающего диска с помощью пипетки Пастера с тонким наконечником.
- Разрежьте мозг на срезы размером 400 мкм с помощью измельчителя тканей со скоростью и силой измельчения 50%.
заметка: Этот этап необходимо выполнить как можно быстрее, так как мозговая ткань не погружается в диссекционную среду.
- Замените диссекционную среду в чашке Петри, покрытой силиконовым эластомером, свежей ледяной средой.
- После того, как измельчитель тканей будет готов, осторожно погрузите мозговую ткань в свежую среду для препарирования и перенесите разрезанную ткань обратно в чашку Петри, покрытую силиконовым эластомером толщиной 90 мм, с помощью скальпеля с прямым лезвием.
- Под стереомикроскопом аккуратно отделите кортикальные срезы с помощью щипцов с тонким наконечником. Для каждого среза осмотрите гиппокамп на предмет морфологии и потенциального повреждения тканей в результате рассечения или разреза.
- Отделите гиппокамп от энторинальной коры и от фимбрии с помощью щипцов с тонким концом и маленьких ножниц Ваннаса. Как правило, на каждое полушарие создается от 6 до 8 срезов гиппокампа.
- Перенесите до 6 срезов гиппокампа во вкладыш для культуры тканей с помощью разрезанной пипетки Пастера и поместите ее в чашку Петри диаметром 35 мм. Убедитесь, что ломтики расположены на расстоянии нескольких миллиметров друг от друга (это гарантирует, что каждый ломтик можно будет изобразить по отдельности).
- Немедленно добавьте ледяную «питательную среду» на дно каждой чашки Петри, под вставкой для культуры тканей, чуть ниже верхней части ободка вставки для культуры тканей.
заметка: Питательная среда содержит 50% минимально незаменимой среды Eagle, 25% сбалансированный раствор соли Хэнкса, 25% лошадиную сыворотку, 5 мг/мл D-глюкозы, 2 ммоль/л L-глютамина, 1% раствор антибиотика-антимикотика и 10 ммоль/л HEPES(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновую кислоту), титруемую до pH 7,2 гидроксидом натрия.
- Меняйте питательную среду на следующий день после вскрытия и каждые 2-3 дня после этого (используйте питательную среду при температуре 37 °C). Убедитесь, что питательная среда добавлена в достаточном количестве, но не настолько, чтобы она переполнилась через мембрану вставки тканевой культуры, что может поставить под угрозу жизнеспособность тканевых срезов.
- Перед использованием в экспериментах срезы ткани должны быть сохранены во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5% углекислым газом в воздухе в течение 12–14 дней.
2. Подготовка органотипических срезов гиппокампа для экспериментального протокола бластной ЧМТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги этого раздела, за исключением визуализации, происходят в культуре тканей с ламинарным потоком.
- Вставьте изготовленные на заказ кольца из нержавеющей стали в 6-луночную пластину (по одному на лунку).
ПРИМЕЧАНИЯ: Кольца имеют ободок с выемкой (который должен находиться в положении «12 часов») и плотно прилегают к лункам, в то время как вставки для тканевых культур легко помещаются в этот ободок. Следите за тем, чтобы кольца были вымыты бактерицидным дезинфицирующим средством, тщательно промыты очищенной водой, помещены в автоклав, а также заранее дали остыть.
- Заполните лунку 6-луночного планшета предварительно подогретой (37 °C) бессывороточной «экспериментальной средой» с йодидом пропидия.
заметка: Экспериментальная среда с йодидом пропидиума составляет 75% минимальной эссенциальной среды Eagle, 25% сбалансированного раствора соли Хэнкса, 5 мг/мл D-глюкозы, 2 ммоль/л L-глутамина, 1% раствор антибиотика-антимикотика, 10 ммоль/л HEPES и 4,5 мкмоль/л йодида пропидия, титруемый до pH до 7,2 гидроксидом натрия.
- Следите за тем, чтобы средний уровень не поднимался выше выемки кольца. Перенесите 6-луночный планшет с кольцами обратно в инкубатор на 1 ч, чтобы убедиться, что температура среды составляет 37 °C непосредственно перед переносом вкладышей для тканевых культур
.
- Перенесите вкладыши с тканевыми культурами с органотипическими срезами из 35-миллиметровых чашек Петри в 6-луночный планшет с кольцами и экспериментальную среду с помощью щипцов.
- Перманентным маркером сделайте точку на ободке вставки в положении «3 часа».
заметка: Во время эксперимента вставки будут удалены из 6-луночного планшета. Этот шаг облегчает возврат вкладыша в исходное положение после воздействия ударной волны и легко отслеживает каждый срез на протяжении всего протокола.
- Пометьте каждую 6-луночную пластину уникальным именем и датой и составьте карту скважин каждой лунки, назвав каждую скважину (например, A, B, C и т. д.) и каждый срез в каждой лунке (например, 1, 2, 3 и т. д.), чтобы каждый срез имел уникальный идентификатор (например, A1, A2, A3 и т. д.).
- Перенесите 6-луночный планшет в инкубатор на 1 час непосредственно перед визуализацией, чтобы убедиться, что срезы имеют температуру 37 °C.<бр/>
заметка: Избегайте переполнения среды или пузырьков воздуха под мембраной вставки тканевой культуры, которые могут поставить под угрозу жизнеспособность срезов.
- Через 1 ч после переноса в экспериментальную среду визуализируйте каждый срез по отдельности с помощью флуоресцентного микроскопа (объектив 2X, NA 0,06), оснащенного соответствующим фильтром возбуждения (BP 535/50 нм) и излучения (LP 610 нм) для оценки состояния среза перед проведением протокола травмы><.
примечания: Срезы, которые демонстрируют участки плотного красного окрашивания на этой стадии, должны рассматриваться как имеющие нарушенную жизнеспособность и должны быть исключены из дальнейшего анализа (обычно они составляют менее 10% от общего числа полученных срезов). Убедитесь, что визуализация выполняется последовательно и как можно быстрее, чтобы свести к минимуму время, в течение которого срезы находятся вне инкубатора (обычно для получения изображения из 6 лунок требуется чуть менее 30 минут).
- Всегда держите крышку 6-луночной пластины закрытой. На внутренней стороне крышки может образоваться конденсат. Если это произошло, кратковременно воспользуйтесь феном на низкой настройке.
- Убедитесь, что все условия визуализации идентичны в разные дни и между экспериментами.
заметка: Целью визуализации является количественная оценка флуоресценции тканей; Следовательно, этот шаг важен для обеспечения воспроизводимости результатов и возможности сравнения данных.
3. Погружение и транспортировка вставок из тканевых культур с органотипическими срезами гиппокампа
- Сразу после визуализации, в ламинарном проточном колпаке, из 6-луночного планшета с помощью щипцов извлекается одна культура ткани.
- Осторожно переложите вкладыш в стерильный полиэтиленовый пакет (3 x 5 дюймов), предварительно заполненный 20 мл теплой (37 °C) экспериментальной среды, только что очищенной от 95% кислорода и 5% углекислого газа><.
заметка: Убедитесь, что экспериментальную среду, обогащенную кислородом и углекислым газом, в течение не менее 40 минут барботировали 95% кислорода и 5% углекислого газа с помощью барботера из синтерированного стекла внутри бутылки Dreschel и перенесли в стерильные полиэтиленовые пакеты внутри ламинарного проточного капюшона для культуры тканей с помощью шприца объемом 20 мл с бактериальным фильтром и стерильной заполняющей трубкой (127 мм). Немедленно закройте пакеты и перенесите их в инкубатор при температуре 37 °C не менее чем на 1 час перед переносом вкладыша для культуры тканей.
- Убедитесь, что каждый стерильный пакет имеет правильную маркировку (с идентификацией пластины и лунки). Повторите этот шаг для каждой вставки для культуры тканей. Тщательно исключите попадание пузырьков воздуха при запечатывании стерильных пакетов (это делается надежно, скрутив верхнюю часть пакетов и наложив пластиковый зажим).
- Верните стерильные пакеты с вкладышами для тканевых культур и 6-луночные планшеты с экспериментальной средой в инкубатор с температурой 37 °С.
- Через 1 ч тщательно упакуйте стерильные пакеты с вкладышами для тканевых культур в пластиковые коробки внутри терморегулируемой коробки, заполненной деионизированной водой при температуре 37 °C, чтобы сохранить органические срезы при физиологической температуре на протяжении всего протокола воздействия ударной волны.
4. Подготовка ударной трубки и органотипическое воздействие ударной волны на гиппокамп
- Наденьте защитные ботинки со стальным носком, лабораторный халат и перчатки во время подготовки электрошоковой трубки и воздействия ударной волны.
- Закрепите раму стерильного держателя пакета болтами к дистальному фланцу амортизаторной трубки, убедившись, что центральное отверстие совмещено с выходным отверстием амортизатора (с помощью заглушки).
- Установите два датчика давления радиально: датчик 1 в средней части приводной секции и датчик 2 в дистальном фланце амортизаторной трубки (рис. 1A). Подключите преобразователи давления к осциллографу через блок питания источника тока.
- Убедитесь, что все выпускные клапаны амортизаторов и регуляторы расхода закрыты.
- Откройте внешнюю линию сжатого воздуха и зарядите электромагнитный клапан до 2,5 бар.
- Откройте предохранительный клапан баллона сжатого воздуха и медленно откройте регулятор давления, чтобы увеличить давление примерно до 5 бар.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Давление, установленное для этого регулятора, должно быть немного выше самого высокого давления разрыва мембраны.
- Подготовьте диафрагмы, разрезав листы полиэстера толщиной 23 мкм на квадраты размером 10 x 10 см2. Подготовьте ручки с помощью автоклавного скотча и приклейте их к верхней и нижней части каждой диафрагмы.
- Расположите одну диафрагму (одинарный паз двойного затвора - конфигурация с одинарной диафрагмой) или две диафрагмы (оба слота двойного затвора - конфигурация с двойной диафрагмой) в казенной части ствола (рис. 1B).
- Центрируйте мембраны и зажимайте их с помощью четырех болтов и гаек M24, последовательно закрепляя их диагонально симметричным образом и следя за тем, чтобы мембраны не мялись.
- Зажмите каждый стерильный пакет по отдельности в вертикальном положении на раме держателя, следя за тем, чтобы поверхность вкладышей в тканевые культуры с органотипическими срезами гиппокампа была обращена к выходному отверстию шоковой трубки, а вкладыш для тканевой культуры был центрирован внутри стерильного пакета (рис. 1C). Убедитесь, что стерильный пакет надежно зажат со всех сторон, чтобы обеспечить прочную и равномерную иммобилизацию.
- Надевайте наушники и защитные очки при давлении на ударную трубку. Включите блок питания источника тока и осциллограф для получения данных об ударной волне (скорость захвата 50 мегаотсчетов/с, длина записи 20 мс, 1 миллион точек) и закройте электромагнитный клапан.
- С помощью ручки регулировки потока на панели управления амортизаторной трубкой медленно нагнетайте давление в объемной секции амортизатора амортизатора для конфигурации с одной мембраной или в обеих объемных секциях драйвера и в двойной казенной части амортизаторной трубки в конфигурации с двойной мембраной.
заметка: В конфигурации с одной мембраной разрывное давление будет зависеть только от материала и толщины мембраны, и мембрана будет самопроизвольно разрываться при достижении давления разрыва материала. В конфигурации с двойной мембраной давление разрыва также будет зависеть от перепада давления газов как в камере водителя, так и в камере с двойным затвором, а для контролируемого разрыва мембран предохранительный клапан с двойным затвором открывается вручную при достижении заданного давления.
- Как только мембрана разорвется (издавая громкий шум), быстро закройте поток сжатого воздуха с помощью ручки потока и откройте электромагнитный клапан.
заметка: Общий объем секции драйвера может быть изменен путем вставки гасящих сегментов, что позволяет получить более широкий диапазон пикового избыточного давления и продолжительности ударной волны. Идеальная комбинация параметров ударной волны должна быть достаточной для того, чтобы вызвать повреждение тканей, но не настолько высокой, чтобы это привело к вставке тканевой культуры или деформации или разрыву стерильного мешка.
- Подвергните каждый стерильный пакет культуре тканей, вставьте его в одну волну ударной трубки и немедленно верните его в терморегулируемую коробку, прежде чем новый стерильный пакет будет извлечен из коробки и закреплен на раме держателя. Убедитесь, что шаги 4.10–4.14 выполняются как можно более плавно и быстро (в течение нескольких минут), чтобы предотвратить охлаждение экспериментальной среды, так как температура ниже 37 °C может препятствовать развитию травмы.
- После того, как все вкладыши для тканевых культур подверглись воздействию ударной волны (или фиктивного протокола), верните их в исходный 6-луночный планшет и соответствующую лунку (внутри ламинарного проточного тканевого колпака) и верните в инкубатор.
- Держите 6-луночный планшет в инкубаторе с 5% углекислым газом в воздухе при температуре 37 °C до дальнейшей визуализации.
- Включите фиктивные элементы управления для каждого эксперимента и воздействие ударной волны на срез.
заметка: Фиктивные срезы обрабатываются так же, как и срезы, подвергшиеся воздействию ударной волны (запечатываются в стерильных пакетах с экспериментальной средой, транспортируются в лабораторию ударной трубки в той же терморегулируемой коробке и подвешиваются на металлической раме в течение эквивалентного периода времени), но ударная трубка не обжигается.
