Создание модели болезни Альцгеймера в мозге рыбок данио с помощью инъекции амилоидных пептидов

Аннотация

Bhattarai, P., et al. Моделирование токсичности амилоида-β42 и нейродегенерации в мозге взрослых рыбок данио. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует процедуру введения мономерных амилоидных пептидов в передний мозг взрослых рыбок данио-рерио для создания амилоидной токсичности, имитируя повреждение нейронов, наблюдаемое при болезни Альцгеймера

Протокол

1. Получение пептида Aβ42

1. Синтезировать пептиды (см. табл. 1) с использованием стандартного химического состава 9-флуоренилметоксикарбонила (Fmoc) с 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониумгексафторфосфатом (HBTU) в качестве реагента для связывания на автоматизированном твердофазном синтезаторе пептидов. Масштаб синтеза составил 100 мкмоль.
2. Загрузите в автоматический синтезатор пептидов 500 мг смолы, защищенной Fmoc, в качестве твердой фазы (загрузка 0,2 ммоль/г). Загрузите растворенные Fmoc-защищенные аминокислоты в концентрацию 0,5 М в требуемом объеме и в расчете для соответствующего синтезатора.
   заметка: Расчеты сделаны для того, чтобы обеспечить возможность связывания каждой защищенной Fmoc аминокислоты дважды с 5-кратным превышением каждого строительного блока по отношению к смоле.
3. Растворите необходимые реагенты для синтеза пептидов в диметилформамиде (ДМФА). Например, приготовьте активатор HBTU в концентрации 0,48 М, 45% v/v N-метилморфолина (NMM) (основание) и 5% v/v уксусного ангидрида (укупорочная смесь) для покрытия непрореагировавших аминогрупп.
4. Отделите все пептиды от смолы, непрерывно перемешивая твердую подложку с помощью мешалки в свежеприготовленной смеси для расщепления, состоящей из трифторуксусной кислоты (ТЖК): триизопропилсилана (ТИС): воды: дитиотреитола (ДТТ) при 90 (об./об.): 5 (об./об.): 2,5 (об./об.): 2,5 (м/об.) в течение 4 ч. Используйте 10 мл для масштаба синтеза 100 мкмоль.
5. Осадите расщепленный продукт, добавив смесь для расщепления до 100 мл ледяного диэтилового эфира. Пропустите через фильтрационную установку, содержащую фильтр из политетрафторэтилена (ПТФЭ) с размером пор 0,45 мкм, и промойте 20 мл ледяного диэтилового эфира.
6. Соберите отфильтрованный пептид из фильтровальной бумаги и растворите 100 мг осажденного пептида в 5 мл дистиллированной деионизированной воды: ацетонитрил в соотношении 1:1.
7. Очистите с помощью обратной фазы жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) на полупрепаративной ВЭЖХ, оснащенной колонкой из пористого полистирола дивинилбензола с размером гранул 10 мкм.
   1. Предварительно нагрейте колонну и поддерживайте ее на уровне 50 °C с помощью нагревательного устройства для колонны. Соберите все основные фракции с помощью автоматизированного сборщика фракций, применяя градиент от 5% до 100% растворителя B в течение 25 мин со скоростью 4 мл/мин.
      заметка: Растворитель А составляет 0,1% ТЖК в воде, а растворитель В — 0,1% ТЖК в ацетонитриле.
   2. Контролируйте хроматограмму на длине волны 220 нм, соберите соответствующие пики и проанализируйте с помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
8. Подтвердите чистоту с помощью аналитической обратной фазовой жидкостной хроматографии сверхвысокого давления (УПЛХ) с длиной волны 220 нм, мониторинга с помощью ультрафиолетового (УФ) детектора при прохождении образца через аналитическую колонку C18 (размер гранул 1,7 мкм). Подтвердите пептидный продукт методом масс-спектрометрии.
   заметка: UPLC соединен с масс-спектрометрией ионизации с электрораспылением (ESI-MS) и тандемным квадрупольным детектором.
9. Лиофилизируйте правильные фракции нужного пептида в колбе с круглым дном, подав вакуум 0,052 мбар на пушистый порошок. Подключите вакуумный насос к морозильной камере при температуре -78 °C. Хранить при температуре -80 °C неограниченное время.
10. Используйте лиофилизированный пептид для приготовления исходного раствора в концентрации 1 мМ в смеси ацетонитрила, ДМФА и аналитической воды в соотношении 1:1:1 для проведения экспериментов. Такой раствор может храниться не менее 6 месяцев, так как пептиды в нем не агрегируются.

2. Приготовление инъекционной смеси

1. Приготовьте фосфатно-солевой буфер (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) для разбавления лиофилизированных пептидов.
2. Растворите пептид до конечной концентрации 20 мкМ в PBS. Приготовьте этот раствор в свежем виде. Хорошо перемешайте и храните на льду до инъекции. Не превышайте 30 минут, чтобы предотвратить агрегацию в растворе.

3. Анестезия

1. Приготовьте стоковый раствор анестетиков, 0,1% этил-м-аминобензоата метансульфоната (MESAB), в обычной воде для рыб из циркуляционной системы. Приготовьте обезболивающий раствор до конечной концентрации 0,0025% (v/v).
2. Высадите нужное количество рыб из их резервуаров в транспортировочную емкость с 5 л воды системы.
3. Наполовину заполните пластиковую чашку Петри (90 мм) 40 мл анестетиков. Используйте эту посуду для инъекций.
4. Инкубируйте рыб в анестетиках до тех пор, пока оперкулярное движение не прекратится.

4. Церебровентрикулярная микроинъекция

1. Подготовка инъекционного аппарата
   1. Подготавливают стеклянные инъекционные капилляры с помощью игольчатого пуллера со следующими параметрами: цикл нагрева, 537; цикл вытягивания, 250; скорость, 1,5 с; время, 80 мс.
   2. Доведите настройку давления на источнике давления до 25 фунтов на квадратный дюйм.
   3. Установите параметры микроинжектора на 20 фунтов на квадратный дюйм для удержания и 10 фунтов на квадратный дюйм для выброса, 2,5 фунта на квадратный дюйм для периода и 100 мс для стробирования.
   4. Нагрузите стеклянный капилляр раствором для инъекций. Вставьте стеклянный капилляр в держатель микровпрыска. Отрегулируйте угол впрыска на 45°.
2. Поместите одну рыбу в новую чашку Петри, наполненную раствором для анестезии.
3. Держите рыбу щипцами и ориентируйте для инъекции.
4. Создайте разрез с помощью кончика иглы 30 G в черепе над тектумом зрительного нерва, где встречаются две боковые пластины. Не вставляйте наконечник в ткани мозга, это может вызвать кровотечение и повреждение.
5. Вставьте стеклянный капилляр в щель.
   1. Используйте только кончик иглы и не проникайте более чем на 1 мм через череп. Продолжайте держать рыбу и вставьте кончик стеклянного капилляра через место разреза.
   2. Ориентируйте кончик стеклянного капилляра в сторону конечного мозга под углом 45°. Введите 1 μл раствора. Жидкость диспергируется сразу после инъекции.

5. Восстановление

1. Поместите рыбу обратно в транспортировочный контейнер до тех пор, пока она не восстановится. Подключите контейнер к регулярно циркулирующей воде для рыб, чтобы обеспечить оптимальное качество воды.
   заметка: Восстановление обычно должно занимать 1 минуту. Если это занимает больше времени, рыб необходимо держать в анестетиках в течение меньшего времени (экспериментатору необходимо это оптимизировать).

Результаты

Таблица 1: Последовательности пептидов Aβ42 и TR-Aβ42.

Телефон

пептид	Пептидная последовательность	МВт (г/моль)
Аβ42	DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA	4514.1
ТР-Аβ42	GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHRDSGYEVHHQKLVFFAE...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Fmoc-защищенные аминокислоты	IRIS Biotech GmbH (Марктредвиц, Германия)		Аминокислоты на основе Fmoc для синтеза твердофазных пептидов (SPPS)
N,N,N',N'-Тетраметил-О-(1H-бензотриазол-1-ил)гексафторфосфат урона (HBTU)	IRIS Biotech GmbH (Марктредвиц, Германия)	РЛ-1030	активатор
Оксима	IRIS Biotech GmbH (Марктредвиц, Германия)	РЛ-1180	Супрессор рацемизации
N,N-диизопропилэтиламин	IRIS Biotech GmbH (Марктредвиц, Германия)	СОЛ-003	основа
Диметилформамид	IRIS Biotech GmbH (Марктредвиц, Германия)	СОЛ-004	растворитель
N-метилморфолин	Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Германия	А12158	основа
1-Гидрат гидроксибензотриазола (HOBT)	Sigma-Aldrich Co. LLC. (Сент-Луис, Миссури, США)	157260 ОЛДРИЧ	активатор
Пиперидин	MERCK KGaA (Дармштадт, Германия)	822299	Реагент для снятия защиты Fmoc
Дихлорметан (ДХМ)	MERCK KGaA (Дармштадт, Германия)	106050	растворитель
Муравьиная кислота (ФК)	MERCK KGaA (Дармштадт, Германия)	100264	Буферный компонент для ВЭЖХ
Трифторуксусная кислота (ТЖК)	MERCK KGaA (Дармштадт, Германия)	808260 (Английский	Реагент Clevage Mixture
Триизопропилсилан (ТИС)	MERCK KGaA (Дармштадт, Германия)	233781 ОЛДРИЧ	Реагент Clevage Mixture
Ацетонитрил (для UPLC/LCMS)	Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH	34967-1Л	растворитель
Ацетонитрил (для ВЭЖХ)	VWR International Ltd, Англия	83639.32 Материал 83639.32	растворитель
Диэтилетер	VWR International Ltd, Англия	No 23811.326 Материал 23811.326	Растворитель для осаждения пептидов
Дитиотритол (ДТТ)	VWR International Ltd, Англия	0281-25Г	Реагент Clevage Mixture
ТентаГель S RAM Fmoc катковая амидная смола	Rapp Polymere GmbH (Тюбинген, Германия)	С30023	Твердофазный для СППС
Пептидный синтез шприцы 5 мл с входящими в комплект фильтрами	Intavis AG (Кёльн, Германия)	34.274	Реакционная трубка для SPPS и для клевы из твердой фазы
Фильтр из политетрафторэтилена (ПТФЭ)	Сарториус Стедтим (Обань, Франция)	11806-50-Н	Фильтрация осажденных пептидов
Шприцевой фильтр из поливинилиденфторида (ПВДФ)	Carl Roth GmbH + Co. KG Карлсруэ	КС78.1	Предварительная фильтрация для ВЭЖХ
Пептидный синтезатор	Intavis, Кёльн, Германия	ResPep SL	Автоматизированный синтезатор твердофазных пептидов
Водный альянс ВЭЖХ	Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США	Воды 2998, Воды e2695	Полупрепаративная обратная фазовая жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ)
PolymerX, размер валика 10μм, 250x10 мм	Phenomenex Ltd. Германия	00Г-4328-Н0	Колонка ВЭЖХ на основе дивинилбензола из пористого полистирола
Milli-Q Advantage A10, с фильтром Milli-Q	EMD Millipore Corporation, Биллерика, штат Массачусетс, США	LCPAK0001	Система очистки воды
Фильтрационная установка	Сарториус Стедтим (Обань, Франция)	16307	Фильтрационная установка для осаждения пептидов
UPLC Aquity с УФ-детектором	Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США	М09УПА 664М	Аналитический ВЭЖХ с обратной фазой ультра для ЖХ-МС
ACQUITY UPLC BEH C18, размер борта 1,7 мкм, 50x2,1 мм	Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США	186002350	Аналитическая колонка С18
Детектор ACQUITY TQ	Уотерс, Милфорд, Массачусетс, США	КББ908	Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением (ЭСИ-МС)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6	Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Германия	16706, 101542	Лиофилизатор с вакуумным насосом
Считыватель пластин Paradigm	Бекман Коултер
MESAB (этил-м-аминобензоат метансульфонат)	Сигма-Олдрич	А5040
Чашки Петри	Сарштедт	821.472
Фосфатно-солевой буфер	Life Technologies, GIBCO	10010-056
игла	Бектон-Дикинсон	305178
Препарирующий микроскоп	Olympus, Leica, Zeiss	Зависит от производителя
Пинцет Дюмон	Мировые прецизионные приборы	501985
Щипцы для рассечения Gillies	Мировые прецизионные приборы	501265
Стеклянные инъекционные капилляры	Мировые прецизионные приборы	ТВФ10
ПикоСопло	Мировые прецизионные приборы	5430-12
Пневматический PicoPump	Мировые прецизионные приборы	SYS-PV820
Кольцевой осветитель; Кольцевая световая направляющая	Паркленд Сайентифик	ILL-RLG

) Тариф