Прямая стереотаксическая инфузия бета-амилоидных белков в мозг для модели болезни Альцгеймера

Аннотация

Источник: Jean, Y. Y. et al., Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует точное стереотаксическое вливание бета-амилоида в зубчатую извилину для создания мышиной модели болезни Альцгеймера. Точное определение координат и контролируемая доставка бета-амилоидных белков приводят к деградации нейронов, нарушая обработку памяти и способствуя развитию болезни Альцгеймера.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка хирургических инструментов и растворов для хирургии

1. Автоклав всех хирургических инструментов из нержавеющей стали.
2. Приготовьте 70% этанол путем разбавления абсолютного этанола 200-й крепости стерильной деионизированной дистиллированной водой молекулярного качества.
3. Прикрепите иглу 29 G к шприцу Hamilton. Очистите внутреннюю часть шприца и иглы Hamilton, многократно набирая и выталкивая наночистую воду в течение 1 минуты. Повторите эту процедуру с 70% этанолом.
   1. Извлеките поршень и иглу из шприца Гамильтона. Сушка деталей на воздухе в кожухе с ламинарным потоком O/N.
   2. Перед использованием облучайте иглу и шприц ультрафиолетовым светом в течение 30 минут.
4. Приготовьте солевой раствор путем растворения хлорида натрия (NaCl) в молекулярной воде до конечной массовой концентрации 0,9%. Стерилизуйте раствор, профильтровав его через фильтр с порами 0,2 мкм.

2. Приготовьте олигомерный бета-амилоид (Aβ1-42)

1. Мономеризовать и ресуспендировать рекомбинантный человеческий Aβ1-42 в диметилсульфоксиде (ДМСО) до 5 мМ точно так, как описано в публикации Fa' и др.
2. Разбавьте 5 мМ Aβ1-42 стерильным (1х) фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS) до 100 мкМ за день до операции.
3. Хорошо перемешайте раствор путем растирания.
4. Инкубировать раствор Aβ1-42 в течение 12 ч при температуре 4°C.
   заметка: Контрольные растворы, такие как разбавление ДМСО в PBS или скремблированный/обратный пептид Aβ1-42, должны быть приготовлены таким же образом, как и Aβ1-42.

3. Определение координат инъекции

1. Используйте атлас мозга взрослой мыши, чтобы определить точные передне-задние (AP), медиально-латеральные (ML) и дорсально-вентральные (DV) координаты для интересующей области мозга.
   заметка: Чтобы проиллюстрировать технику, в качестве мишени мы выбрали зубчатую извилину гиппокампа со следующими координатами от брегмы: AP, -2,00 мм; ML, ±1,3 мм; DV, -2,2 мм. Отрицательный знак, предшествующий значению AP, указывает на то, что он находится на расстоянии 2,00 мм позади брегмы. Знак ± перед значением ML указывает направление влево и вправо от центра. Наконец, отрицательный знак, предшествующий DV, указывает на то, что он движется вентрально от поверхности мозга.

4. Настройка стереотаксического кадра

1. Наденьте хирургическую маску для лица, чистый лабораторный халат и стерильные хирургические перчатки.
2. Протрите стереотаксический инструмент и адаптер мыши 70% этанолом.
3. Постелите на столешницу стерильную хирургическую простыню.
4. Поместите стереотаксический инструмент с адаптером для мыши поверх стерильной хирургической простыни.
5. Протрите грелку мыши 70% этанолом. Расположите грелку над кроватью со стереотаксической рамой. Используйте универсальную лабораторную маркировочную ленту, чтобы прикрепить грелку к ложу адаптера для мыши.
   1. Прикрепите грелку к насосу рециркуляции теплой воды в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Включите насос рециркуляции теплой воды, установите температуру на 37 °C и подождите, пока она достигнет этой температуры.
6. Прикрепите шприц Hamilton объемом 50 мкл с иглой 29 G к стереотаксической раме, прикрутив его к моторизованному вертикальному инъекционному стволу в соответствии с указаниями производителя.
7. Включите стерилизатор шариков и подождите, пока он достигнет заданной производителем температуры.
   заметка: Он используется для стерилизации инструментов из нержавеющей стали между животными. Для стерилизации инструментам требуется 20 секунд контакта с шариками.
8. Включите конфорку, установите ее на 42 °C и поставьте сверху чистую пустую клетку.
9. Пока шприц Гамильтона закреплен на стереотаксической раме, используйте моторизованный стереотаксический инжектор для набора раствора Aβ1-42.
   заметка: Наберите в шприц более 4 мкл раствора, а затем с помощью стереотаксического инжектора установите объем инъекции. Эксплуатируйте инжектор в соответствии с инструкциями производителя.

5. Подготовка животных

1. Определите вес мыши с помощью весов.
2. Обезболивайте мышей коктейлем кетамин/ксилазин в дозе 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина путем внутрибрюшинного введения (ВП). Контролируйте глубину анестезии по потере рефлекса защемления пальцев ног.
3. После того, как мышь будет успокоена, возьмите машинку для стрижки волос и побрейте ей голову, чтобы обнажить кожу над черепом.
4. Поместите мышь на верхнюю часть грелки поверх стереотаксической кровати.
5. С помощью шпателя откройте рот и поместите резцы внутрь защитного кожуха. Закрепите наконечник над лицевой стороной мыши. Зажмите его аккуратно и не слишком туго.
6. Расположите двусторонние перекладины уха в слуховом проходе, чтобы зафиксировать голову. Переместите каждую перекладину внутрь до тех пор, пока она не коснется черепа, а затем поверните винт, чтобы зафиксировать ее.
   1. Чтобы убедиться, что голова надежно закреплена, указательным пальцем осторожно надавите на голову. Если головка закреплена должным образом, она не сдастся и не сдвинется при нажатии.
7. Нанесите каплю крема для глаз или глазные капли на глаза, чтобы они оставались влажными. Убедитесь, что глаза увлажнены на протяжении всей хирургической процедуры.
8. Для дезинфекции места операции с помощью стерильных ватных тампонов на кожу над черепом наносится раствор бетадина с последующим добавлением 70% этанола. Проведите чередование очистки бетадином и 70% этанолом еще 2 раза.

6. Хирургия и инфузия

1. С помощью скальпеля сделайте разрез 2-3 мм по средней линии волосистой части головы, а затем прямыми тонкими ножницами удлините линию разреза на 1,0-1,5 см, чтобы обнажить сагиттальный шов, брегму и лямбду черепа, ориентиры, на которых основаны стереотаксические координаты. Используйте микрозажимы, чтобы держать кожу на расстоянии.
   заметка: Положения брегмы и лямбды описаны в атласе мозга мыши "Мозг мыши в стереотаксических координатах".
2. Возьмите ватный тампон, смочите его в стерильном физрастворе и используйте его для чистки черепа. Затем используйте чистый сухой ватный тампон, чтобы высушить череп.
3. С помощью стерильной ручки тонкой ручкой наметьте точку на брегме. С помощью стереотаксического микроманипулятора расположите шприц Гамильтона так, чтобы кончик иглы просто касался точки на брегме.
   1. Запишите координату DV.
   2. Чтобы проверить, выровнена ли ось AP черепа, переместите шприц Гамильтона назад так, чтобы кончик иглы касался точки лямбда.
   3. Запишите положение DV. Убедитесь, что координаты DV для брегмы и лямбды находятся в пределах 0,5 мм.
      заметка: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму разницу в DV между брегмой и лямбдой.
4. С помощью микроманипулятора верните наконечник иглы шприца Гамильтона обратно в точку брегмы.
5. Запишите начальное положение точки доступа.
6. Рассчитайте конечное положение AP путем вычитания 2,00 мм из начальной координаты AP.
7. С помощью микроманипулятора переместите иглу шприца Hamilton в конечную координату AP.
8. Запишите текущую координату машинного обучения.
9. Вычислите левую и правую конечные координаты ML, прибавив или вычтя 1,3 мм от начальной координаты ML.
10. С помощью микроманипулятора переместите иглу шприца Гамильтона в любую из конечных координат ML.
    1. Прикоснитесь кончиком иглы к поверхности черепа на обоих концах координат ML и запишите координаты DV, убедившись, что значения находятся в пределах 0,5 мм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму разницу DV между двумя конечными координатами ML.
    2. При этом в конечной координате протяните иглу вверх на 0,5-1 см над черепом. Возьмите стерильную ручку тонкой иглой, чтобы отметить точку на поверхности черепа. Повторите этот шаг для контралатеральной стороны черепа.
11. Отведите шприц Hamilton в сторону.
12. Прикрепите к дрели сверлильную головку диаметром 0,8 мм. Возьмите дрель обеими руками, поставьте локти на поверхность стола для устойчивости и расположите сверлильную головку немного выше точки шарпи по левой или правой координате ML. Активируйте сверло, опустите наконечник сверла на поверхность черепа, чтобы ввести отверстие в черепе. Повторите этот шаг для контралатеральной стороны.
    заметка: Из вновь введенных отверстий может возникнуть небольшое кровотечение. Если есть кровотечение, то промокните кровь чистым сухим ватным тампоном.
13. Переместите шприц Hamilton обратно в нужное положение над любым из недавно введенных отверстий ML. Опустите иглу Гамильтона сразу за черепом. На этом этапе будьте осторожны, чтобы не проколоть мозг. Чтобы убедиться, что игла прошла через череп, возьмите указательный палец и осторожно прижмите иглу к черепу, чтобы убедиться, что игла не выходит из отверстия.
14. Запишите начальную координату DV.
15. Вычислите конечную координату DV, вычтя 2,2 мм из начальной координаты DV.
16. Опустите иглу вниз до конечной координаты DV.
17. Активируйте стереотаксический инжекторный насос для закачки 4 мкл Aβ1-42 в зубчатую извилину со скоростью 0,5 мкл/мин.
18. Когда инфузия будет завершена, оставьте иглу на месте еще на 1 минуту, чтобы свести к минимуму обратный поток раствора из места инъекции.
19. Переместите иглу на другую сторону мозга и повторите шаги 6.13-6.18.

7. Изъятие животных и послеоперационный уход

1. Открутите амбушюры и защитный кожух лица/носа. Снимите мышь с аппарата.
2. С помощью щипцов студенческого стандартного образца подтяните кожу головы, а затем заклейте рану швом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кетамин гидрохлорид (100 мг/мл)	Генри Шейн Медикал	1049007	100 мг кетамина на 1 кг животного
Ксилазин (20 мг/мл)	Генри Шейн Медикал	Нет в наличии	10 мг ксилазина на 1 кг животного
Аβ1-42	Дэвид Теплоу/Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе	Нет в наличии	100 мкМ; Этот амилоид был использован в работе
Аβ1-42	Бахем	Н-1368	Может использоваться вместо амилоида из лаборатории Теплова
Аβ1-42	Американский пептид	62-0-80В	Может использоваться вместо амилоида из лаборатории Теплова
Омлет Aβ1-42	Американский пептид	62-0-46В	Может быть использован в качестве контрольного пептида для сравнения Aβ1-42
GenTeal Lubricant Гель для глаз	Компания «Новартис»	Нет в наличии	Для поддержания влажности глаз мыши во время операции; можно найти в местных аптечных магазинах
Refresh Optive Lubricant Глазные капли	Аллерган	Нет в наличии	Для поддержания влажности глаз мыши во время операции; можно найти в местных аптечных магазинах; Может использоваться вместо GenTeal
Бетадин	Стоелтинг	50998	Для санитарной обработки и дезинфекции
Круглый/конический шпатель	ВВР	82027-490	Для открывания рта животного
Зажимы Bulldog Serrefines (размер челюсти 9x1,6 мм; Длина 28мм)	Инструменты для точной науки	18050-28	необязательный; Для разведения кожи головы во время инъекций
Прямые тонкие ножницы (режущая кромка 25 мм; Длина 11,5см)	Инструменты для точной науки	14060-11	Для стрижки кожи головы
#3 Рукоятка скальпеля	Инструменты для точной науки	10003-12
#11 Хирургическое лезвие	Инструменты для точной науки	10011-00	Для выполнения разреза кожи головы
Студенческий щипцы стандартного образца (размер кончика 2,5x1,5 мм; Длина 11,5см)	Инструменты для точной науки	91100-12	Для удержания кожи головы закрытой во время наложения швов
Комбинированный комплект триммера	Кент Сайентифик	КЛ9990-1201	Для бритья волос
T / Pump Рециркулятор теплой воды	Кент Сайентифик	ТП-700	Для согревания животного во время операции
Многоразовая площадка для военного минирования (5 дюймов x 10 дюймов)	Кент Сайентифик	ТПЗ-0510ФЭА	Для крепления его к рециркулятору теплой воды T/Pump для согревания животного во время операции
Аккумуляторная микродрель	Стоелтинг	No 58610	Используйте стальные жернова 0,8 мм для сверления отверстий в черепе
Лабораторный стандартный стереотаксический прибор с адаптером для мыши и неонатальной крысы	Стоелтинг	No 51615
Просто для мышиного стереотаксического инструмента	Стоелтинг	51730	Можно использовать вместо Stoelting Cat. #51615
Квинтэссенция стереотаксического инжектора	Стоелтинг	No 53311
Стерилизатор сухих стеклянных шариков	Стоелтинг	No 50287	Для стерилизации инструментов из нержавеющей стали
Стерильная хирургическая простыня (18 x 26 дюймов)	Стоелтинг	50981
Шприц Hamilton 50 мл, модель 705 RN SYR, NDL	Компания Hamilton	7637-01	Для инъекций в мозг используйте разные шприцы для разных растворов
Игла 29 калибра, малая ступица RN NDL	Компания Hamilton	7803-06	Для крепления к шприцу Гамильтона для инъекций в мозг
1 мл шприцев с туберкулином BD	ВВР	BD309659	Для введения анестезии и физраствора
Игла 30 калибра (0,5 дюйма)	ВВР	BD305106	Для введения анестезии и физраствора
Портативные электронные весы серии CS (Ohaus)	ВВР	65500-202	Для взвешивания животных для определения дозы анестезии
Конфорка (размеры верхней панели 7,25x7,25 дюйма)	ВВР	47751-148	Для согревания животных после операции
Sofsilk Silk Шовный материал C-1 Резка 3/8, 12 мм	Ковидьен	С1173	Для закрытия раны
Vetbond Клей для тканей (3M)	Санта Крус Биотехнологии	СК-361931	Опционально: для помощи в закрытии раны; Используйте со швом.
Стерильные аппликаторы с деревянным валом и хлопковым наконечником	Научный Фишер	Тел.: 22-029-488	Для очистки и подсушивания операционной раны
Предметные стекла для микроскопа Fisherbrand Superfrost Plus	Научный центр Фишера	Телефонный номер 12-550-15	Для сбора срезов мозга
VWR Micro Cover Glass 24 x 50 мм	ВВР	48393241	Для крепления предметных стекол микроскопа
Шприцевой фильтр Thermo Scientific Nalgene 0,2 мкм	Научный центр Фишера	194-2520	Для стерилизации физиологического раствора
Стерильные маркеры для кожи с двойным наконечником от Viscot Medical	Медлайн	VIS1422SRL91	Для отметки координат на черепе

Кабель гг. гг.