Изучение накопления альфа-синуклеина в первичных эмбриональных дофаминовых нейронах мышей

Аннотация

Источник: Er, S. et al., Изучение индуцированного предварительно сформированным фибриллом накопления α-синуклеина в первичных дофаминовых нейронах среднего мозга эмбриональных мышей. J. vis. exp. (2020).

В этом видео демонстрируется процесс количественного определения накопления альфа-синуклеина в эмбриональных дофаминовых нейронах мыши, предварительно обработанных предварительно сформированными фибриллами альфа-синуклеина. В нем описаны этапы фиксации, окрашивания и количественного определения дофаминовых нейронов, содержащих агрегаты альфа-синуклеина, с помощью иммунофлуоресценции.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Подготовка

1. Приготовьте среду дофаминовых нейронов (DPM) с 0,46% D-глюкозы, 1% L-глутамина, 1% N2, 0,2% примоцина, дополненные DMEM/F12. Отфильтруйте DPM после смешивания ингредиентов. Храните DPM при температуре 4 °C и прогревайте каждую аликвоту только один раз.
   заметка: ДПМ не должен содержать нейротрофический фактор глии (GDNF), так как он снижает накопление α-синуклеина в дофаминовых нейронах.
2. Приготовьте пипетки из силиконизированного стекла, которые обладают чрезвычайно гидрофобными свойствами, тем самым сводя к минимуму прикрепление к поверхности и потерю клеток во время первоначальной обработки эмбриональных нейронов.
   1. Добавьте 10 мл силиконизирующей жидкости в 1 л дистиллированной воды и перемешайте, перемешивая в сосуде объемом 2 л. Оставьте стеклянные пипетки погруженными в силиконизирующий раствор на 15 минут.
   2. Промойте пипетки 3–5 раз дистиллированной водой. Высушите пипетки в течение ночи при комнатной температуре (RT) или в течение 1–2 часов при температуре 100–120 °C в стерильном помещении с подогревом, чтобы ускорить сушку.
   3. Стерилизуйте пипетки стандартным автоклавированием в герметичном автоклавном пакете.
3. Приготовьте покрытые поли-L-орнитином (PO) 96-луночные планшеты с прозрачным дном, добавив 60 мкл раствора PO в средние лунки 96-луночной пластины, которые будут использоваться для заема нейронов, оставив по крайней мере один ряд/столбец лунок по краям пластины во избежание краевых эффектов. Держите пластину с покрытием на ночь при температуре 4 °C или 4 часа при RT.
4. Перед нанесением покрытия на клетки полностью аспирируйте PO и трижды промойте клетки 100 мкл 1x фосфатного буферного раствора (PBS). Отсадите 1x PBS из лунок и держите крышку пластины открытой для полного высыхания.
   заметка: Есть возможность собирать использованные ПО и фильтровать их для повторного использования. Это можно повторить дважды для одного и того же решения PO.
5. Добавьте 50 μL DPM в предварительно покрытые лунки. Отсадите DPM из лунок пластиковым наконечником объемом 100 мкл и одновременно поцарапайте дно лунки круговыми движениями, чтобы удалить покрытие по периметру каждой лунки. В середине скважины останется остров с покрытием PO.
6. Под ламинарный колпак добавьте 10 μL DPM в середину каждого островка с покрытием, чтобы создать микроостровки.
   заметка: Планшет с покрытыми DPM микроостровками можно держать под ламинарным проточным колпаком в течение 1–2 часов во время изоляции клеток.

2. Выделение вентрального дна среднего мозга из эмбрионов мышей E13.5

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к рисунку 1 для этапов диссекции дна среднего мозга.

1. Перед вскрытием заполните чашку Петри диаметром 10 см буфером Дульбекко и держите ее на льду.
2. Усыпьте беременную самку мыши E13.5 в соответствии с рекомендациями учреждения. Положите мышь на спину и распылите на переднюю часть тела 70% этанола. Приподнимите кожу над маткой с помощью щипцов и сделайте разрез хирургическими ножницами, чтобы обнажить матку.
3. Аккуратно удалите матку и поместите ее в заранее подготовленную чашку Петри на льду.
4. С помощью хирургических ножниц под ламинарным капюшоном в РТ аккуратно извлеките эмбрионы из матки. Удалите все остатки плаценты из эмбрионов с помощью щипцов и поместите их в новую чашку Петри диаметром 10 см, заполненную буфером Дульбекко.
5. С помощью рассекательных щипцов или игл отрежьте заднюю четверть головы от мест, отмеченных черными стрелками на рисунке 1А. Отрежьте отрезанный кусок от остальной части эмбриона (рисунок 1B).
6. Поместите заднюю часть отрезанного куска к наблюдателю (рисунок 1C) и аккуратно разрежьте его от каудального к краниальному (рисунок 1D). На 0,5 мм ниже отверстия черепа разрежьте область^{размером 2}–3^мм2 диаметром 2 мм, показанную на рисунке 1Е.
7. Соберите вентральное дно среднего мозга (см. рисунок 1F) в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Держите микроцентрифужную трубку на льду до тех пор, пока в ней не соберутся все дны среднего мозга.
   заметка: В качестве альтернативы, дно среднего мозга может быть собрано с помощью микропипетки объемом 1 мл после вскрытия мозга всех эмбрионов.

3. Создание первичных эмбриональных культур среднего мозга из эмбрионов мыши E13.5 в формате 96-луночных планшетов

1. После забора дна среднего мозга у всех эмбрионов в одной и той же пробирке объемом 1,5 мл удалите остаточный буфер Дульбекко и трижды промойте кусочки ткани 500 мкл Ca²⁺, Mg²⁺ free Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Удалите HBSS и добавьте в пробирку 500 мкл 0,5% трипсина. Выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут.
3. Во время инкубации подогрейте 1,5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 37 °C, добавьте 30 мкл DNase I в FBS и перемешайте. Кроме того, отполируйте огневкой кончик пипетки из силиконизированного стекла. Убедитесь, что отверстие не имеет острых краев и имеет примерно такой же размер, как наконечник для микропипетки объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для растирания можно использовать наконечник для микропипетки объемом 1 мл с низкой адгезией. Тем не менее, пипетки из силиконизированного стекла, по-видимому, дают наилучшие результаты.
4. Как только инкубация на шаге 3.2 закончится, добавьте 500 мкл смеси FBS/DNase в частично переваренную ткань. Используйте стеклянную пипетку для растирания ткани в смеси FBS и трипсина. Растирайте до тех пор, пока ткани не разделятся на мельчайшие, едва заметные частицы. Избегайте образования пузырей во время растирания.
5. Дайте оставшимся частицам осадиться на дне микроцентрифужной пробирки под действием силы тяжести. Не пипетируя осадок на дне, соберите надосадочную жидкость в пустую коническую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл.
6. Разбавьте FBS/DNase I на стадии 3.3 (98:2) 1000 мкл HBSS для получения FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Перемешайте пипеткой вверх и вниз. Добавьте 1 000 μл новой смеси к оставшимся частицам в микроцентрифужной пробирке. Снова разомните и повторите шаг 3.5.
7. Повторите предыдущий шаг еще раз, чтобы израсходовать все FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. После того, как вся надосадочная жидкость будет собрана внутри пробирки объемом 15 мл (из этапов 3.5, 3.7 и 3.8), используйте настольную центрифугу для вращения надосадочной жидкости (~3 мл) при 100 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость, не касаясь гранулированных клеток на дне.
9. Промойте гранулу ячейки, добавив 2 мл DPM в трубку, и уменьшите ее до 100 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторите промывку 2 раза><, чтобы свести к минимуму мусор в гранулированных ячейках. ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежий, подогретый DPM для культивируемых нейронов. Для этапов стирки DPM не обязательно должен быть свежим, но должен быть предварительно нагрет до 37 °C.
10. Разбавьте клетки свежим, теплым DPM и переложите их в микроцентрифужную пробирку. Количество ДПМ для разведения зависит от количества эмбрионов, используемых для рассечения тканей. Например, используйте 150 мкл DPM для разбавления клеток, полученных из десяти эмбрионов.
11. Перенесите 10 мкл клеток в DPM в микроцентрифужную пробирку. Смешайте их с 10 мкл 0,4% трипанового синего морилки. Подсчитайте живые (т.е. трипановые синие отрицательные) клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 30 000 клеток для покрытия на лунку, чтобы получить ~1 000 дофаминовых нейронов на лунку. Если плотность клеток превышает ~30 000 клеток на 6 мкл, дополнительно разбавьте клетки DPM перед нанесением покрытия так, чтобы объем посева составлял не менее 6 мкл.
12. Не касаясь дна лунок, извлеките DPM из микроостровков, созданных на шаге 1.6.
13. Чтобы получить воспроизводимую плотность клеток в каждой лунке, смешайте клетки с помощью щадящего пипетирования перед нанесением покрытия в лунку. С помощью микропипетки объемом 1–10 мкл добавьте 6 мкл клеток в середину лунки в месте расположения каждого бывшего микроостровка.
14. Заполните пустые лунки по краям пластины 150 μл воды или 1x PBS, чтобы свести к минимуму испарение из лунок, содержащих культуры нейронов. Инкубировать планшет в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%_CO2 в течение 1 ч.
15. Через 1 ч выньте планшет из инкубатора, добавьте по 100 мкл DPM в каждую лунку с ячейками и поместите обратно в инкубатор.
16. Через два дня после нанесения покрытия (день in vitro 2, или DIV2) удалите 25 μL и добавьте 75 μL свежего DPM, чтобы довести окончательный объем среды до 150 μL и максимально избежать испарения.
17. Замените половину среды на свежую DPM (т.е. удалите 75 μL и добавьте 75 μL свежего DPM) при DIV5. Не меняйте носители после DIV5.

4. Индукция агрегатов α-синуклеина в первичных эмбриональных дофаминовых нейронах путем посева предварительно сформированными фибриллами

После любой работы с предварительно сформированными фибриллами (PFF) с α-синуклеином очистите ламинарный колпак или любое оборудование, которое могло контактировать с PFF, 1% додецилсульфатом натрия (SDS), затем 70% этанолом.

1. Перед началом эксперимента разбавьте PFFs с 1x PBS до конечной концентрации 100 мкг/мл. Ультразвуком разбавленные PFF в микроцентрифужных пробирках с помощью ультразвуковой аппарата в ванне высокой мощности с охлаждением на водяной бане при температуре 4 °C в течение 10 циклов, 30 с ВКЛ/30 с ВЫКЛ.<бр/> заметка: Крайне важно, чтобы фибриллы были правильно обработаны ультразвуком для генерации фрагментов длиной ~50 нм. Размер ультразвуковых PFF может быть измерен непосредственно по изображениям окрашенных PFF, полученным с помощью просвечивающего электронного микроскопа. Ультразвуковая обработка может быть достигнута, как описано выше, в мощном ультразвуковом аппарате для ванны. В качестве альтернативы можно использовать ультразвуковую терапию для наконечников. Ультразвуковые PFF можно хранить при температуре -80 °C в небольших аликвотах, чтобы избежать многократных циклов замораживания/размораживания.
2. На DIV8 добавьте 3,75 мкл 100 мкг/мл PFF на лунку к 150 мкл среды в лунке до конечной концентрации 2,5 мкг/мл. Используйте такое же количество PBS 1x для контрольной группы.
3. Приготовьте 4% параформальдегид (PFA) в 1x PBS и храните аликвоты при температуре -20 °C. Для этого выполните следующие действия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PFA токсичен; Во время подготовки надевайте маску и перчатки, всегда работайте под ламинарным капюшоном, а также утилизируйте все твердые и жидкие отходы PFA в соответствии с указаниями учреждения.
   1. Подогрейте 500 мл 1x PBS в сосуде объемом 1 л. Поместите в сосуд мешалку и поставьте сосуд на магнитную мешалку с функцией нагрева. Отрегулируйте температуру в диапазоне 40–60 °C, чтобы предотвратить закипание, сохраняя раствор теплым.
   2. Отмерьте 20 г порошка PFA под капотом в одноразовом пластиковом мерном контейнере. Осторожно добавьте порошок PFA в сосуд, наполненный 1x PBS. Начните помешивать раствор.
   3. Добавьте в раствор 200 μл 5 М гидроксида натрия и продолжайте перемешивать ~15 минут, пока PFA полностью не растворится.
   4. После того, как раствор станет однородным, добавьте 168 мкл 5 М хлористого водорода, чтобы сбалансировать pH до ~7. Проверяйте pH с помощью одноразовых цветных индикаторных полосок pH.
   5. Снимите сосуд с нагревателем и дайте ему остыть до температуры RT. Отфильтруйте раствор и аликвоту для хранения при температуре -20 °C. Разморозьте аликвоты при RT перед использованием, и не замораживайте повторно после использования.
4. На DIV15 удалите всю среду из лунок с помощью пипетирования. Добавьте 50 мкл 4% PFA в каждую лунку для фиксации клеток и инкубируйте в течение 20 минут при РТ. После инкубации извлеките PFA из лунок и добавьте 100 μL 1x PBS в каждую лунку для промывки клеток. Удалите 1x PBS и промойте еще 2 раза.
5. Оставьте 100 мкл 1x PBS в каждой лунке, чтобы избежать высыхания. Храните планшет при температуре 4 °C до проведения иммунохимии.

5. Иммунофлуоресцентное окрашивание и автоматизированная визуализация первичных эмбриональных дофаминовых нейронов в 96-луночных планшетах

1. Удалите 1x PBS и проникните клетки, добавив 100 μл 0,2% Triton X-100 в PBS (PBST) на лунку и инкубируйте при RT в течение 15 минут.
2. Удалите PBST и добавьте 50 μL 5% нормальной лошадиной сыворотки (NHS) на лунку в PBST. Чтобы блокировать неспецифическую активность антигена, инкубировать при ЛТ в течение 1 ч.
3. Разбавьте первичные антитела против тирозингидроксилазы (ТГ) и pS129-αsyn (1:2000) в 5% NHS в PBST. Добавьте по 50 мкл разведенных антител в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
4. Удалите антитела и добавьте 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки. Снимите 1x PBS и повторите стирку 2x.
5. Чтобы предотвратить обесцвечивание флуоресцентных молекул, начинайте работать в условиях минимальной освещенности. Разведите вторичные флуоресцентно меченные антитела (1:400) в ПБСТ. Добавьте по 50 мкл разведенных антител в каждую лунку и инкубируйте при ЛТ в течение 1 ч.
6. Удалите раствор антитела и добавьте по 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, чтобы промыть клетки. Снимите 1x PBS и повторите стирку 2x.
7. Удалите 1x PBS, добавьте 50 мкл 200 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в лунку для окрашивания ядер культивируемых клеток и инкубируйте при RT в течение 10 минут.
8. Промойте ячейки 3 раза по 100 мкл 1x PBS в течение 5 минут каждая. Храните по 100 мкл 1x PBS в каждой лунке после последней промывки. Накройте пластину алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 °C до нанесения изображения.
9. Визуализируйте первичные эмбриональные дофаминовые нейроны в 96-луночной проекционной пластине с помощью сканера с высоким содержанием пластин (см. Таблицу материалов), оснащенного 10-кратным объективом.
10. Отрегулируйте настройки в зависимости от технических характеристик 96-луночной пластины, таких как тип пластины, производитель, размер, расстояние между лунками, а также тип и количество среды.
11. Выберите область визуализации лунки, чтобы охватить все ячейки в микроостровке. Выберите пример для настройки автофокуса. Основывайте первоначальный фокус на DAPI.
12. Откалибруйте время регистрации для каждого флуоресцентного канала в зависимости от интенсивности окрашивания в контрольных лунках. Отрегулируйте параметры таким образом, чтобы в контрольных лунках, обработанных PFF, можно было четко различить дофаминовые клетки, содержащие агрегаты pS129-αsyn в клеточной соме, что позволило однозначно количественно определить pS129-αsyn-положительные и pS129-αsyn-отрицательные клетки.
    заметка: Лунки, не содержащие PFF, не должны иметь окрашивания для pS129-αsyn; Таким образом, эти лунки могут быть использованы в качестве отрицательного контроля для регулировки интенсивности pS129-αsyn.
13. Визуализируйте все выбранные лунки с 10-кратным объективом одновременно для всех каналов с иммунофлуоресцентным окрашиванием с точно такими же параметрами.
14. При необходимости можно пометить включения α-синуклеина в подмножестве лунок антителами, специфичными к нитевидному α-синуклеину, чтобы подтвердить, что изменения в числе pS129-αsyn-положительных включений отражают снижение накопления белка, а не ингибирование фосфорилирования или дефосфорилирования pS129-αsyn.
15. Повторите шаг 5.3, заменив антитело pS129-αsyn антителом к филаменту α-синуклеина (1:2000). Визуализируйте окрашенный агрегированный α-синуклеин, как показано на шаге 5.13.

Результаты

Рисунок 1: Вскрытие дна среднего мозга из эмбриона мыши E13.5. (A) Места разрезов на задней части головы отмечены черными стрелками и белыми пунктирными линиями. (B) Кусочек был отделен от остальной части эмбриона. Снятый кусок обводится кружком. (C) Деталь была повернута на 90° лицом к наблюдателю. (D) Фигура открывалась черными стр...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,4% Трипановый синий морилка	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	15250061
15 мл CELLSTAR Полипропиленовая трубка	Greiner Bio-One GmbH, Фрикенхаузен, Германия	188261
4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	10236276001
5 млн HCl	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
5 м NaOH	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
96-луночный ViewPlate (черный)	Перкин Элмер, Уолтем, Массачусетс, США	6005182
99,5% этанол (EtOH)	Altia Oyj, Раямяки, Финляндия	Н/Д
AquaSil Силицизирующая жидкость	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	ТС-42799
Автоклавная микроцентрифужная пробирка 1,5 мл	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
Ультразвуковое устройство Bioruptor	Diagenode, Льеж, Бельгия	B01020001
Ca2+, Mg2+ свободный сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	14175-053
Программные пакеты CellProfiler и CellAnalyst	Н/Д	Н/Д	Бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом
Центрифуга 5702	Eppendorf AG, Гамбург, Германия	5702000019
CO2-инкубатор	HeraCell, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	Н/Д
Счетная камера	BioRad Inc., Геркулес, Калифорния, США	1450015
Микроскоп сверхвысокого разрешения DeltaVision с воздушным столом и шкафом	GE Healthcare Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США	29254706
Deoxyribonuclease-I (Dnase I)	Roche, Базель, Швейцария	22098700
D-глюкоза	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	21331–020
Ослик против мыши AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	А21202
ослик против кролика AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	А31573
ослик против овец AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	А11015
Буфер Дульбекко	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	10500056
Батончик для перемешивания из ПТФЭ Fisherbrand Plain Economy	Fisher Scientific, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	11507582
Автоматизированная система обработки изображений ImageXpress Nano	Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США	Н/Д
L-глютамин	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	25030–032
Мышиная моноклональная антитирозингидроксилаза	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German	МАБ318
N2 дополнение	Gibco, Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США	17502–048
Обычная лошадиная сыворотка	Vector Laboratories Inc., Берлингейм, Калифорния, США	С-2000
параформальдегид (PFA)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	158127
порошок параформальдегида, 95%	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	158127
pH-Fix, цветные индикаторные полосы	Macherey-Nagel, Дюрен, Германия	92110
Фоспохататный буфер физиологического раствора (PBS)	Н/Д	Н/Д	Медиа-кухня, Институт биотехнологии, Университет Хельсинки
поли-L-орнитин	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	P4957
Примоцин	InvivoGen, Сан-Диего, Калифорния, США	ant-pm-1, ant-pm-2
Моноклональный анти-альфа-синуклеиновый филамент	Abcam, Кембридж, Великобритания	ab209538
Моноклональный антифосфа-серин129-альфа-синуклеин	Abcam, Кембридж, Великобритания	ab51253
RCT Basic, магнитная мешалка IKA	IKA-Werke® GmbH, Штауфен, Германия	3810000
рекомбинантный нейротрофический фактор глии человека (hGDNF)	PeproTech, Роки Хилл, Нью-Джерси, США или Prospec, Несс-Циона, Израиль	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
рекомбинантный альфа-синуклеин мыши (PFFs)	Н/Д	Н/Д	Подарок от соавтора, профессора Кельвина С. Лука
Исследовательский стереомикроскоп	Olympus Corporation, Токио, Япония	SZX10
овечья поликлональная антитирозингидроксилаза	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German	ab1542
TC 20 Автоматический счетчик ячеек	BioRad Inc., Геркулес, Калифорния, США	1450102
Тритон Х-100	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США	11332481001
трипсин	MP Biomedicals, Valiant Co., Яньтай, Шаньдун, Китай	2199700