Получение обогащенной тромбоцитами плазмы из периферической крови человека

Аннотация

В этом видео демонстрируется приготовление высококачественной обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) путем скрининга на количество тромбоцитов, сбора и центрифугирования крови, а также выделения тромбоцитов. Этот PRP используется в терапевтических целях для регенерации и заживления тканей.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными руководящими принципами по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Сбор образцов

1. Скрининг пациентов с использованием предварительного анализа крови для исключения тромбоцитопении и установления исходного количества клеток. Для этого используют гемоцитометр клинического класса для подсчета клеток. Убедитесь, что количество тромбоцитов превышает 150 000 клеток/мкл.

2. Убедитесь, что пациент хорошо гидратирован перед сбором образца. Это может быть обеспечено визуальным осмотром языка, тургором кожи, измерением артериального давления.

3. Соберите 100 мл периферической венозной крови из предкубитальной вены пациента с помощью 2 шприцев по 50 мл, наполненных 5 мл антикоагулянта кислота-цитрат-декстроза-аденин (ACDA) в соотношении 1:10. Наклоните собранные шприцы для правильного смешивания антикоагулянта во избежание свертывания образца крови, прежде чем переходить к следующему этапу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Медленный забор крови может привести к недостаточному смешиванию собранной крови с антикоагулянтом и свертыванию; следовательно, используйте канюлю не менее 18G для сбора крови.

4. Перенесите 100 мл крови из шприцев в 15 мл конических донных центрифугирующих пробирок по 10 мл в каждой пробирке.

2. Центрифугирование и изоляция

1. Поместите центрифужные пробирки в настольную центрифугирующую машину клинического класса, поддерживаемую при комнатной температуре в стерильной среде, и запустите начальный мягкий отжим со скоростью 100 x g в течение 15 минут. Антикоагулянтная кровь разделяется на три слоя, т.е. эритроциты внизу, плазма вверху и охристая шерсть посередине.

2. Пипеткой стерильно нанесите верхний слой трехслойного образца с помощью стерильной спинномозговой иглы 18G и соберите его в отдельную коническую нижнюю центрифужную пробирку. Обеспечьте отдельные пробирки на каждые 10 мл собранной плазмы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Решение о включении охристой шерсти зависит от природы обогащенной тромбоцитами плазмы, которую мы пытаемся выделить, которая, в свою очередь, зависит от характера ее клинического применения. Если желательным продуктом является PRP, бедный лейкоцитами, воздержитесь от включения слоя охристой оболочки, тогда как если желательным продуктом является PRP, богатая лейкоцитами, то верхний слой плазмы вместе с охристой оболочкой выводится пипеткой для второго раунда центрифугирования.

3. Подвергнуть собранную плазму в центрифугирующих пробирках объемом 15 мл с 10 мл плазмы в каждой жесткому спиновому центрифугированию при 1600 x g в течение 20 мин. Тромбоциты присутствуют в плазменной грануле на дне пробирки. Соберите надосадочную жидкость в отдельную пробирку.

4. Пипеткой введите тромбоцитарную гранулу в шприц объемом 5 мл с помощью стерильной спинномозговой иглы 18 G. Соберите все пробирки с гранулами в один шприц объемом 5 мл для применения.

5. Восстановите собранную гранулу в достаточных объемах для клинического использования с помощью надосадочной плазмы в центрифугирующей пробирке после второго раунда центрифугирования.

3. Валидация

1. Подвергните полученную окончательную PRP подсчету клеток с использованием гемацитометра клинического класса для расчета количества тромбоцитов и расчета абсолютного количества тромбоцитов в PRP, градиента концентрации тромбоцитов, достигнутого по сравнению с исходным уровнем, и эффективности восстановления тромбоцитов по протоколу с использованием следующей формулы.
   Абсолютное количество тромбоцитов = количество тромбоцитов PRP в μL x 1000 x объем PRP в мл
   Градиент концентрации тромбоцитов =
   Эффективность восстановления тромбоцитов =
   Например, 100 мл крови с исходным количеством тромбоцитов 200 000 / μL используется для приготовления PRP, и получают 5 мл PRP с конечным количеством тромбоцитов 3 000 000 / μл. Указанные выше параметры рассчитываются следующим образом:
   Абсолютное количество тромбоцитов = 3,000,000 x 1000 x 5 = 15 миллиардов тромбоцитов
   Градиент концентрации тромбоцитов = 3,000,000 / 200,000 = 15
   Эффективность восстановления тромбоцитов = 3,000,000 x 1000 x 5 / 200,000 x 100 = 75%

2. Обеспечить эффективность восстановления протокола через повторяющиеся циклы. Используемый эффективный протокол обеспечивает градиент концентрации, более чем в 5 раз превышающий исходный уровень, с эффективностью восстановления >80%. В зависимости от желаемого использования объема ОТР количество тромбоцитов, которое необходимо сдать, может быть титровано соответствующим образом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раствор антикоагулянта цитрата декстрозы	Fresenius Kabi, Индия	ACDAIP/L/A/19/00	}
BD игла Квинке	Бектон Дикинсон, Испания	405125	18G
DISPOVAN 50 мл шприц	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Индия
DISPOVAN 5 мл шприц	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Индия		}
{{}} Трубка Спинвина коническое дно	Тарсонс, Индия	546021
}Sysmex XN-350	Sysmex Inc., США{	}XN 350
Настольная клиническая центрифугирующая машина	REMI, Индия	R-8C	4x4 хорошо откидной ротор

}{{}}