$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Скрининг участка на наличие метокси-x04-окрашенных бляшек
- С помощью стереотаксического атласа мозга мыши выберите участки мозга, содержащие интересующую область, например, гиппокамп CA1, как это используется в настоящем примере. Поместите каждую секцию в лунку внутри 24-луночной культуральной тарелки, содержащей достаточное количество раствора криопротектора, чтобы предотвратить высыхание секций.
- Осмотрите каждый срез последовательно, чтобы избежать пересыхания срезов, используя следующую процедуру:
- } Добавьте каплю фосфатно-солевого буфера (PBS) на предметное стекло микроскопа с помощью одноразовой пипетки и поместите срез на каплю.
- Изучите срез под флуоресцентным микроскопом, чтобы выявить участки, содержащие метокси-X04, меченные Aβ бляшками.
Примечание: метокси-X04 можно легко визуализировать с помощью флуоресцентного ультрафиолетового (УФ) фильтра (возбуждение 340 - 380 нм).
- Получение изображений областей интереса (ROI) в светлом поле, а также в флуоресцентном режиме без перемещения предметного столика микроскопа, поскольку каждое изображение должно показывать одну и ту же область в обоих полях, чтобы соотнести наличие бляшек непосредственно со структурной областью участка ткани.
- Сохраните и назовите сделанные снимки в соответствии с номером животного. Также запишите номер колодца на табличке и поле для сделанных фотографий. Например, Пример: 9978A1B; Номер животного: 9978; Номер скважины: А1; Поле: Яркое. После завершения визуализации поместите секцию обратно в предназначенную для нее лунку.
Примечание: В конце концов, для каждого рассмотренного участка получаются две картинки, одна в светлом поле, а другая в ультрафиолетовом поле. - Откройте два изображения с одинаковым ROI (одно в светлом поле, а другое в поле UV) в Image J и с помощью плагина MosaicJ выровняйте края двух изображений и сохраните выровненное и объединенное изображение в соответствии с номером ячейки, из которой оно было получено.
- Сохраните картинку в отдельной папке с номером конкретного животного. Объедините изображения, чтобы идентифицировать и локализовать бляшки в срезе ткани и получить полное представление обо всем срезе в двух разных полях (ярком и ультрафиолетовом).
- После завершения процесса скрининга исследуемые срезы хранят при температуре -20 °C в 24-луночном культуральном планшете, содержащем криопротектор, до проведения иммуноокрашивания или дальнейшей обработки.