Юкстацеллюлярная запись и окрашивание для точного картирования нейронной активности у бодрствующей крысы

Аннотация

Источник: Moore, J. D., et al. Юкстацеллюлярный Мониторинг и локализация отдельных нейронов в подкорковых структурах мозга бдительных, ограниченных головой крыс. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует метод сопоставления целлюлярной записи и окрашивания у сдержанной, бодрствующей крысы. Процедура включает в себя запись сигналов от нейронов и введение красителя для точной локализации места записи. Этот метод позволяет точно сопоставлять нейронную активность с анатомической структурой мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Юкстацеллюлярный мониторинг нейронных единиц

1. Протягивайте кварцевые капиллярные трубки на лазерном микропипетке с углекислым газом (см. раздел «Материалы») с диаметром наконечника менее 1 мкм (Рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нагрева будут варьироваться в зависимости от конкретного инструмента, а требуемый диаметр шейки будет варьироваться в зависимости от интересующей структуры мозга. Для записи в таламусе крысы микропипетки имеют горлышки в диапазоне от 5 до 7 мм.
2. Закрепите пипетку на месте под дифференциально-интерференционно-контрастным микроскопом (DIC), оснащенным объективами с большим рабочим расстоянием. Используйте пластилин, чтобы удерживать пипетку на месте на предметном столике микроскопа.
3. Медленно переместите стеклянный блок (толщиной 0,5 - 1 см; кусок стекла, используемый для изготовления ультрамикротомных ножей) в поле зрения с помощью наконечника пипетки. С помощью микроманипулятора столика аккуратно прикоснитесь наконечником пипетки к стеклу, в результате чего он разобьется. При необходимости повторяйте до тех пор, пока внешний диаметр наконечника пипетки не достигнет 1-3 μм (Рисунок 2B, C). Убедитесь, что эти микропипетки имеют импеданс в диапазоне примерно 5–15 МОм.
4. Приготовьте внеклеточный физиологический раствор (135 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl₂, 1 мМ MgCl₂, 5 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота), pH 7,2 с NaOH) и добавьте 2% (w/v) Chicago Sky Blue. Наполните раствором задний конец пипетки с помощью шприца с иглой 30 G или меньше. В качестве альтернативы, для юкстацеллюлярного мечения одиночных клеток, добавьте 2% (w/v) нейробиотина или биотинилированного декстранамина (BDA-3000 или BDA-10000) в солевой раствор вместо Chicago Sky Blue.
5. Поместите крысу внутрь тканевого носка внутри жесткой трубки на подходящую экспериментальную приспособление (Рисунок 1). Подождите не менее 72 часов после операции, прежде чем поместить животное на приспособление для подголовника. Затяните шнурок вокруг верхней части грудины, а не вокруг шеи, чтобы избежать закупорки дыхательных путей. Если дыхание затруднено или затруднено, ослабьте шнурок или сдвиньте его назад. Проводите эту процедуру, пока крыса настороже.
6. Прикрепите удерживающую голову пластину на крысе к соответствующей детали на кондукторе. Для этого сначала приколите пластину подголовника на место, а затем закрепите ее с помощью винта 4-40. Обязательно дождитесь, пока животное успокоится, чтобы избежать приложения чрезмерного крутящего момента к голове. Далее наденьте гайку 8-32 на фиксирующий голову болт, который вживляется в крысу. Затем вкрутите резьбовой стержень из нержавеющей стали к болту головки. Прикрепите удилище к опытному приспособлению таким образом, чтобы его можно было затянуть на месте (Рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крепление животного с помощью болта для головы, а также пластины подголовника сводит к минимуму изгиб устройства и улучшает стабильность записи. В большинстве случаев запись может начаться в первый день удержания головы животного. Однако, если животное чрезмерно ерзает или издает звуки, проведите однодневную тренировку по приучению к подголовнику, прежде чем начинать какие-либо записи. В этом случае оставьте животное на джиге на 15 минут, а затем поместите его обратно в клетку. Повторите этот шаг на следующий день и продолжайте следовать протоколу.
7. Откройте камеру записи и удалите силиконовый гель. Если ткань в трепанации черепа вновь выросла, очистите ее с помощью тонких щипцов.
8. Подсоедините пипетку к моторизованному микроманипулятору и подключите предусилитель верхней сцены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данной демонстрации маленькая релейная цепь на головном каскаде переключается между проводами усилителя и внешним источником тока с высокой податливостью (Рисунок 3A-C). Обратите внимание, что некоторые усилители имеют соответствующий встроенный источник с высоким уровнем податливости.
9. С помощью моторизованного микроманипулятора переместите наконечник пипетки к стереотаксически идентифицированной отметке в записывающей камере. Обратите внимание на координаты этого места. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончик пипетки на черепной коробке.
10. Переместите пипетку в нужное место записи по передне-задней и медиолатеральной осям. Затем продвигайте пипетку вентрально через твердую мозговую оболочку до тех пор, пока она не окажется примерно на 500 мкм дорсально к предполагаемому месту записи.
11. Медленно продвигайте пипетку, прослушивая на аудиомониторе события усиления напряжения, записанного между наконечником пипетки и проводом сравнения. После выявления пиковых явлений продолжайте перемещать пипетку на 0-100 мкм до тех пор, пока не будут наблюдаться положительные отклонения напряжения, превышающие приблизительно 500 мкВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда это произойдет, сопротивление электрода увеличится примерно в 1,5-10 раз.
12. Запись должна начинаться после того, как единица была изолирована, наряду со всеми другими поведенческими и физиологическими показателями, представляющими интерес. В данной демонстрации самостоятельно генерируемые движения вибриссы контролируются с помощью высокоскоростной видеосъемки (см. раздел Материалы ).
13. Чтобы пометить место записи, переключите провода электродов на подключение к источнику тока. Это можно сделать несколькими способами, используя либо релейную цепь (Figure 3A-C), встроенный источник тока на усилителе, либо вручную(Figure 3D). Пропустите импульсы -4 мкА с 2-секундными импульсами при 50% рабочем цикле в течение 4 мин для ионтофоретического введения Chicago Sky Blue через пипетку.
14. Убейте и перфузируйте животное после нескольких процедур маркировки в соответствии со стандартной практикой. Разрез мозга и противостоящее окрашивание по мере необходимости для определения анатомического расположения места записи. Контрокрашивание ткани для реакционной способности цитохромоксидазы. В качестве альтернативы можно определить месторождения Chicago Sky Blue с помощью флуоресцентной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы точно различать различные маркированные единицы, важно, чтобы все этикетки были изготовлены с помощью одной и той же пипетки в один и тот же день, без разжима пипетки между этикетками. В этом случае сайты записи могут быть дифференцированы по их относительному расположению в постфактум гистологии, а также по отмеченным координатам манипулятора каждого участка. Для однозначной идентификации метки следует отмечать на расстоянии не менее 200 мкм друг от друга, и не более 3-5 меток на область мозга.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная оснастка. Схема крысы в механическом приспособлении для экспериментов по электрофизиологическому и поведенческому мониторингу. В приспособлении используются стержень и пластина

Материалы