$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Alexa Fluor маркировки вируса денге
- Перед маркировки реакцию, очищают вируса денге с сахарозой подушки и подготовить необходимые реактивы и оборудование, как указано в протоколе.
- Подготовка свежего 0,2 М буфере бикарбоната натрия, рН 8,5 (маркировка буфера), и 1,5 гидроксиламин буфере, рН 8,3 (Стоп-реагент), как раз перед маркировки и фильтр стерилизуют при 0,2 мкм фильтры шприц.
- Развести около 3x10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ) очищенного вируса денге в 1 мл маркировки буфера в 2 мл трубки. Это могут быть увеличены пропорционально для пакетной маркировки вирус.
- Разведите лиофилизированный Alexa Fluor 594 (AF594) сукцинимидил эфиров до 1 мм в маркировке буфера непосредственно перед маркировки реакции. Другие флуорохромов с Alexa Fluor красителя серии могут быть использованы в соответствии со своими потребностями. Минимизировать воздействие света от этого шага и далее.
- Добавить 100 мкл 1 мМ AF594 краски разбавляют вируса при перемешивании осторожно кончиком пипетки.
- Выдержите смесь маркировки реакции при комнатной температуре на 1 час в темноте. Смешать, осторожно инверсии каждый 15 минут.
- Спиновые трубки кратко в настольные центрифуги и добавьте 100 мкл стоп-реагента к реакционной смеси при перемешивании осторожно кончиком пипетки.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение дополнительный час в темноте. Смешать, осторожно инверсии каждый 15 минут.
2. Очищающий Alexa Fluor помечены вируса денге
- В то же время равновесие очистки колонки с буфером выбора. В этом эксперименте, ПД-10 колонка находится в равновесии с 25 мл HNE буфер (5 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,1 мм ЭДТА), рН 7,4, перед использованием.
- Применение меченых вируса верхней части колонны и начать собирать проточные раз помечены вирус попадает в матрицу. Заполните колонку с HNE буфера, когда все помечены вирус вошел матрицы. Откажитесь от первых 2,5 мл проточных и собирать следующий 2мл меченого вируса фракции.
- Алиготе и хранения очищенной AF594 помечены вируса денге в -80 ° С, вдали от источника света.
- Оттепель один аликвоту и определить титр вируса помечены бляшкой анализ, прежде чем использовать партию меченого вируса.
- Семенной 5x10 4 на лунку Vero клетках, выращенных в М-199 питательную среду, в 4-луночный планшет с покровным на дне и день до заражения.
- Удалить супернатант культуры в хорошо и заражают клетки с множественностью заражения от 1 меченого вируса в 100 мкл объема (разводится в М-199 содержание среду при необходимости) в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
- Удалить inoculums и мыть дважды в покровных 1xPBS.
- Fix клеток в 3% paraformalydehyde для 30 минут.
- Вымойте покровные 3 раза в 1xPBS.
- Permeabilize клеток с пермеабилизации раствора, содержащего 0,1% сапонина и 5% БСА в 1xPBS за 30 минут.
- Инкубируйте клетки с неразбавленным центрифугирования-уточнил супернатанта 3H5 моноклональных антител культуры гибридомы за 1 час во влажной камере, защищенном от света месте.
- Вымойте покровные 3 раза промывочным буфером (1xPBS содержащей 1 мМ хлорида кальция, 1 мМ хлорид магния и 0,1% сапонина).
- Инкубируйте клетки с AF488 анти-мышиного антитела IgG, 1:100 разводят в пермеабилизации решение, за 45 минут во влажной камере, защищенном от света месте.
- Вымойте покровные 3 раза промывочным буфером и промыть один раз в деионизованной воде.
- Приложите край покровного против бумажное полотенце для слива лишней воды и смонтировать на стекло с 8μl Mowiol 4-88, содержащего 2,5% DABCO.
- Разрешить решение для монтажа для установки на ночь при 4 ° С до просмотра с помощью конфокальной микроскопии Zeiss. Последовательная приобретения должны быть выполнены волнующим флуорофора в то время, и переключение между детекторами одновременно.
- Изображения затем анализируется для сотрудничества локализации антител E белка окрашивания меченых вирусов с помощью МНК Zeiss Zen программное обеспечение, чтобы оценить степень маркировки.
3. Представитель Результаты
Примером выхода вируса денге помечены AF594 красителем показано на рисунке 2. Как правило, меньше, чем 10-кратное падение с начальным титром должны быть соблюдены следующие успешной маркировки. Однако следует отметить, что все буферы должны быть готовы свежими маркировки, чтобы быть успешным и Alexa Fluor сукцинимидил эфиры должны использоваться сразу же после восстановления, поскольку они гидролизуются в нереактивном свободных кислот в водных растворах 8.
Далее, помечены вирус должен быть проверен на достаточном флуоресценции перед использованием в экспериментах. Простой анализ иммунофлюоресценции было сделано на клетках Веро и степень маркировки может быть оценена по совместной локализации меченого вируса с анти-E меченых антител белка. Разрыватьдр. клетки были рассмотрены и типичные конфокальной изображение показано на рисунке 3. Сотрудничество локализации анализ изображений с помощью МНК Zen ПО продемонстрировали совпадение коэффициентов в пределах от 0,65 до 0,8, предполагая, что примерно от 65 до 80% вирионы были помечены краской.
Рис 1.Overall схема изображением Alexa Fluor красителем маркировку процедуры вируса денге. Во-первых, соответствующие буферы и очищенный вируса денге готовы. Alexa Fluor красителя восстанавливается и добавляется вируса денге разводят в маркировке буфера. Реакция остановился через 1 час с добавлением стоп-реагента. Впоследствии помечены вирус очищается через колонку исключения размера для удаления свободного красителя. Наконец, меченый вирус снова титруют доска анализ и проверены на флуоресценцию.
Рисунок 2. Среднее количество жизнеспособных вирионов (БОЕ / мл), как определено на мемориальной доске анализа до и после AF594 маркировки. Аликвоту AF594 помечены вируса денге талых и вновь титруют доска анализа и он обычно показывает меньше, чем 10-кратное падение с начиная титр. Ошибка полоски показывают стандартное отклонение дубликатов.
Рисунок 3. Сотрудничество локализации AF594 этикетки с вирусом денге E белков в клетках Веро. Клетки, выращенные на покровных день до были инфицированы AF594 помечены денге в МВД 1 в течение 10 минут при температуре 37 ° C. Клетки последующей фиксации и маркированы с анти-E антитела, и исследуют на колокализации E белка (зеленый) и AF594 маркировку (красный). Флуоресцентные сигналы были визуализированы под 63x увеличением использования Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии. Шкала бар 10 мкм. Желтый указывает области колокализации, как показано на вставке.