Метод расширить γδ Т-клеток из периферической крови мононуклеаров (МКПК) описывается. РВМС полученных γδ Т-клетки стимулируются и расширить с помощью золедронат и интерлейкин-2 (IL-2). Большое расширение масштабов γδ Т-клеток может быть применен к аутологичных сотовой иммунотерапии рака.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Расширение периферической крови человека γδ T клеток с использованием Zoledronate
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человек γδ Т-клетки могут распознавать и реагировать на широкий спектр стресс-индуцированного антигенами, тем самым развивается врожденная широкий противоопухолевыми и антибактериальными деятельности. 1 Большинство γδ Т-клеток в периферической крови у Vγ9Vδ2 Т клеточного рецептора. Эти клетки распознают антиген главного комплекса гистосовместимости-независимым способом и развивать сильные цитолитического и Th1-подобный эффекторные функции. 1 Таким образом, γδ Т-клетки являются привлекательным кандидатом эффекторных клеток рака иммунотерапия. Vγ9Vδ2 Т-клеток реагировать на phosphoantigens, такие как (E)-4-гидрокси-3-метил-бут-2-енил пирофосфат (HMBPP), который синтезируется в бактериях посредством биосинтеза изопреноидов, 2 и isopentenyl пирофосфат (IPP), который производится в эукариотических клетках через мевалоната пути. 3 В физиологическом состоянии, поколения ИПП в nontransformed ячейка не является достаточным для активации γδ Т-клеток. Дисрегуляция мевалоната пути в опухолевых клетках приводит к накоплению IPP и γδ Т-клеток, активации. 3 Поскольку аминобисфосфонатов (таких, как памидронат или золедронат) тормозят фарнезил синтазы пирофосфат (ГЛС), фермент действует на выходе из ИПП в мевалоната пути, внутриклеточные уровни IPP и sensitibity к γδ признание Т-клеток может быть терапевтически увеличился на аминобисфосфонатов. IPP накопления менее эффективен в nontransfomred клеток, чем опухолевые клетки с фармакологически соответствующей концентрации аминобисфосфонатов, которые позволяют нам иммунотерапии рака путем активации Т-клеток γδ с аминобисфосфонатов. 4 Интересно, что IPP накапливается в моноциты, когда РВМС относятся с аминобисфосфонатов, из-за эффективной наркотиков поглощение этих клеток. Моноциты 5, которые накапливаются IPP стать антиген-представляющих клеток и стимулируют Vγ9Vδ2 Т-клеток в периферической крови. 6 На основе этих механизмов, мы разработали методику для крупномасштабного расширения γδ культурах клеток Т использованием золедронат и интерлейкина -2 (IL-2). 7 Другие методы для расширения γδ Т-клетки используют синтетические bromohydrin phosphoantigens пирофосфат (BrHPP) 8 или 2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат (2M3B1PP) 9. Все эти методы позволяют бывшим естественных условиях расширения, в результате чего большое количество γδ Т-клеток для использования в приемных иммунотерапии. Однако, только золедронат является FDA утвержденных коммерчески доступных реагентов. Zoledronate расширенной γδ Т-клетки CD27 дисплей - CD45RA - эффектор фенотип памяти и их функции могут быть оценены IFN-γ производства анализа 7.
Протокол
1. Выделение МКПК
- Нарисуйте крови (7,5-8,0 мл) в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия. Трубка содержит антикоагулянт гепарин натрия и Ficoll-Hypaque плотность жидкости, а также барьер полиэстер гель, который отделяет двух жидкостей. Одноразовая пробирка / крови при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° С) в горизонтальный ротор (поворотно-откидной головкой) в течение 20 мин при 1800 х г. Коммутатор центрифуги тормоза прочь.
- После центрифугирования последовательность слоев происходит следующим образом (если смотреть сверху вниз):) плазмы - Ъ) мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и тромбоцитов - с) плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоциты - е) красные кровяные клетки (рис. 1).
- Сбор фракция плазменного слоя, делая 5 до 10 мм плазмы выше интерфазе, не нарушая слой клеток. Плазма может быть использована для культуры (раздел 2.5).
- Урожай фракции, обогащенной (МКПК) на межфазной с пипеткой и трансфер в 15 мл коническую трубку.
- Вымойте РВМС с 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), обращая трубки 5 раз, а затем центрифуги в течение 5 мин при 400 х г.
- Повторите промывание шаги в два раза, а затем ресуспендируют осадок клеток в 5 мл PBS. Определить число клеток. Обычно 1,3 x10 6 клеток выделяют из 1 мл цельной крови.
- Определить частоту и фенотип γδ Т-клеток в РВМС методом проточной цитометрии (раздел 3) (рис. 2).
2. Расширение γδ Т-клеток
- Центрифуга клеточные суспензии в 15 мл конические пробирки в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре, и отбросить супернатанты.
- Подготовка питательной среды (СМ), добавив человеческого ИЛ-2 (IL-2) и золедронат (Зомета) до конечной концентрации 1000 МЕ / мл и 5 мкМ, соответственно. ALyS203 (Cell науки и технологический институт) или OpTmizer (Invitrogen) средства массовой информации поддерживать хорошие расширения γδ Т-клеток (более подробная информация в ссылках 6 и 9). Зомета содержится в жидком виде (4 мг/5мл флакон). Для подготовки 5 мкМ раствор, добавьте 50 мкл Zometa до 30 мл питательной среды.
- Ресуспендируют осадок клеток в культуральной среде и приспосабливаться к 1х10 6 кл / мл.
- Внесите 1 мл CM содержащей 1x10 6 клеток в каждую лунку 24-луночного планшета. Для крупных культурах, клетки могут быть посеяны на уровне 0,5 х 10 6 клеток / см 2 в зависимости от площади поверхности пластины скважин, блюдо, или колбу.
- Добавить аутологичной плазмы (раздел 1.3), объединенных человека АВ сывороток, или ФТС, так что это примерно 10% от объема культура (100 мкл на каждую лунку 24-луночного планшета). Место пластин в увлажненных 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение 24-48 часов.
- Поддержание культуры на плотность клеток 0.5-2 х 10 6 клеток / мл. Добавьте свежую среду, содержащую человеческий IL-2 (1000 МЕ / мл) только (без Зомета) каждые 2-3 дня, и передача культивируемых клеток в новые скважины или колбы в случае необходимости, в зависимости от степени пролиферации клеток (рис. 3). Поставка плазме или сыворотке в среду, так что концентрация сывороточного может поддерживаться не менее 1%.
- Урожай клеток на 12-14 день и определить частоту, фенотип, и функции γδ Т-клеток с помощью проточной цитометрии (см. ниже).
3. Фенотипическая анализ с помощью проточной цитометрии
- Передача 200 мкл образцов, содержащих 2 х 10 5 клеток к флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) труб.
- Добавьте 2 мл холодного PBS и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г. Затем, ресуспендируют гранул в 50 мкл буфера FACS (PBS + 1% ФТС + 0,1% азид натрия). Добавьте 5 мкл каждого антитела к образцов (моноклональные антитела, приведены в таблице 1).
- Инкубировать на льду в темноте в течение 20 мин.
- Добавить 2 мл FACS буфера для каждого образца, а затем вихрь. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C. Тщательно слейте супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 300 мкл буфера FACS и вихря. Анализ образцов на проточный цитометр (рис. 2).
4. IFN-γ производства анализа 10
- За день до теста, подготовить стимулятор клетки при культивировании 3-5 x10 5 клеток Дауди / мл в RPMI 1640, плюс 10% FCS (RPMI-10) в течение ночи с Зомета (5 мкМ) (далее назначенный Z-Дауди).
- Сбор Z-Дауди и ресуспендируют в RPMI-10 на 2x10 6 клеток / мл. Добавить 100 мкл Z-Дауди (2х10 5) в каждую лунку с круглым дном 96-луночный планшет.
- Подготовка γδ Т-клеток на 2х10 6 клеток / мл в RPMI-10 содержащие Brefeldin при 20 мкг / мл. Передача 100 мкл γδ Т-клеточной суспензии (2x10 5) в каждую лунку содержащих Z-Дауди клетки или для контроля скважин (100 мкл RPMI-10 только, или RPMI-10 с 20 нг / мл форбол 12-миристат-13-ацетат[PMA] плюс 2 мкг / мл иономицина).
- Смешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
- Центрифуга пластине в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° С и ресуспендируйте гранул в 200 мкл холодного PBS.
- Передача образцов FACS труб. Добавьте 4 мл холодного PBS и центрифуги трубы в течение 5 мин при 400 х г при 4 ° C.
- Ресуспендируют гранул в 50 мкл FACS буфера с FITC-сопряженных анти-TCRVγ9 (5 мкл) и PE/Cy5-conjugated анти-CD3 мАт (2,5 мкл). Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 100 мкл IntraPrep реагента 1 и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре.
- Удалить супернатант аспирацией и добавьте 100 мкл реагента 2 IntraPrep. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре без встряхивания.
- Добавьте 5 мкл PE-сопряженных анти-IFN-γ МКА к пробирке. Инкубируйте защищенном от света месте в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить 4 мл PBS в каждую пробирку и центрифуги в течение 5 мин при 400 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют осадок клеток в 0,5 мл буфера FACS.
- Анализ клеток потока цитометр. Ворота на CD3 + TCRVγ9 + клеток и изучение экспрессии IFN-γ (рис. 4).
5. Представитель Результаты:
Важно, чтобы определить процент γδ Т-клеток в РВМС на начало культуры. Как показано на рис. 2, процент CD3 + + TCRVγ9 γδ Т-клеток в РВМС составил 1,6% в день 0. Доминирующей популяции CD27 + CD45RA + наивным или CD27 + CD45RA - центральный фенотипы памяти. Когда γδ Т-клеток были эффективно стимулировали, они образовали кластеры в дни 3-5 (рис. 3, Б). Когда формирования кластера было отложено, рост других типов клеток, такие как CD4 + или CD8 + Т-клеток αβ или NK клетки могут доминировать рост γδ Т-клеток (рис. 3 C и D). После 14 дней культивирования частота γδ Т-клеток увеличилось до более чем 93,8% из культивируемых клеток успешно γδ Т клеточных культурах (рис. 2 E). Культурный γδ Т-клетки upregulated NKG2D и CD69 выражении (рис. 2 G и Н). Они проявили CD27 - CD45RA - эффектор фенотип памяти (рис. 2 F). Функции γδ Т-клеток были оценены в отношении продукции цитокинов и цитотоксичность. Внутриклеточного IFN-γ окрашивание показало, что γδ Т-клеток производится IFN-γ в ответ на PMA / иономицина лечения или Z-Дауди клетки, которые накопились после лечения ИПП золедронат (рис. 4). Эти результаты показывают, что золедронат может эффективно стимулировать и расширения функциональных γδ Т-клеток.
| трубка | FITC | PE | ECD | PE/Cy5 |
| 1 | CD3 | CD19 | CD45 | CD14 |
| 2 | CD3 | TCRαβ | CD4 | CD8 |
| 3 | CD3 | CD56 | ||
| 4 | TCR Vγ9 | TCRαβ | CD45 | CD3 |
| 5 | TCR Vγ9 | NKG2D | ||
| 6 | TCR Vγ9 | CD69 | ||
| 7 | TCR Vγ9 | IgG1 мыши | ||
| 8 | TCR Vγ9 | CD45RA | CD27 | |
| 9 | TCR Vγ9 | IgG1 мыши | IgG1 мыши |
Таблица 1. Моноклональные антитела, используемые в многоцветном окрашивании γδ Т-клеток. Примером фенотипического анализа γδ Т-клеток производится в нашей лаборатории показано на рис. 2.
Рисунок 1. Разделение РВМС. Кровь (7,5-8,0 мл) втягивается в BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с гепарином натрия и непосредственно центрифугировали в течение 20 мин при 1800 х г. После центрифугирования в результате слои, как показано сверху боttom:) Плазма - б) РВМС и тромбоцитов - с) Плотность раствора - г) полиэстер гель - е) гранулоцитов - е) красных кровяных телец.
Рисунок 2. Типичный фенотип поверхности γδ Т-клеток. РВМС стимулировали золедронат и ИЛ-2 в течение 14 дней. Клетки окрашивали FITC-меченого анти-TCR Vγ9 и PE/Cy5-labeled анти-CD3 контролировать расширение γδ Т-клеток (и Е). γδ Т-клетки были идентифицированы по их выражению TCRVγ9, и их выражение CD27 и CD45RA (B и F), NKG2D (С и G), или CD69 (D и H) был рассмотрен.
Рисунок 3. Представителю γδ культур Т-клеток. РВМС стимулировали ИЛ-2 (1000 МЕ / мл) и золедронат (5 мкМ). Представитель поля показано на рисунке (IX71 инвертированного микроскопа [Olympus] х 200). Кластеры и агрегатов γδ Т-клеток может наблюдаться на 3 день (А) и 5-й день (B), когда γδ Т-клетки были успешно расширены. В отличие от этого, нет кластеров или агрегатов наблюдались при γδ Т-клеток рост не был адекватным (С и D).
Рисунок 4. IFN-γ производства. γδ Т-клетки инкубировали с RPMI-10 только () или PMA / иономицина (В) или Z-Дауди (C) в течение 4 часов. Во-первых, поверхность выражение TCRVγ9 окрашивали и IFN-γ производства был рассмотрен внутриклеточного IFN-γ окрашивание.
Рисунок 5. Кинетика γδ культуре Т-клеток. (А) Абсолютное число культивируемых клеток, (B) процент γδ Т-клеток, и (C) абсолютное число Т-клеток γδ в указанных точках времени.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, представленный здесь обеспечивает эффективное расширение γδ Т-клетки из РВМС. γδ Т-клетки активируются и расширена золедронат и ИЛ-2 разработки полного эффекторные функции, отражается производство цитокинов и цитотоксичность. Было сообщено, что синтетические bromohydrin phosphoantigens пирофосфат (BrHPP) и 2-метил-3-бутенил-1-пирофосфат (2M3B1PP) также расширить γδ Т-клеток, однако они не являются коммерчески доступными. В противоположность этому, золедронат уже лицензирована для клинического применения в качеств...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент имя | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| Зомета | Novartis Pharma К. К | золедронат | |
| PROLEUKIN | Novartis Pharmaceuticals | человеческий рекомбинантный ИЛ-2 | |
| BD Vacutainer КПП сотовый Подготовка труб с натрий Гепарин | BD | 362753 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| ALyS203 среднего | Сотовые науки и технологический институт | 0301-7 | |
| OpTmizer | Invitrogen | 0080022SA | |
| brefeldin | Сигма | B5936-200UL | |
| форбол 12-миристат-13-ацетат (PMA) | Сигма | P1585-1мг | |
| иономицина | Сигма | 13909-1мл | |
| IntraPrep | BECKMAN COULTER | A07803 | |
| анти-человеческий CD3-FITC или PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07746 FITC A07749 PE/Cy5 | |
| анти-человеческий CD4-ECD | BECKMAN COULTER | 6604727 | |
| анти-человеческий CD8-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607011 | |
| анти-человеческий CD14-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07765 | |
| анти-человеческий CD19-PE | BECKMAN COULTER | A07769 | |
| анти-человеческим CD45-ECD | BECKMAN COULTER | A07784 | |
| анти-человеческий CD56-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07789 | |
| анти-человеческий TCRαβ-PE | BECKMAN COULTER | A39499 | |
| анти-человеческий TCR Vγ9-FITC | BECKMAN COULTER | IM1463 | |
| анти-человеческий CD27-PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | 6607107 | |
| анти-человеческий CD45RA-ECD | BECKMAN COULTER | IM2711 | |
| анти-человеческий CD69-PE | BD | 555531 | |
| анти-человеческий NKG2D-PE | BECKMAN COULTER | A08934 | |
| Анти-humal IFNγ-PE | BECKMAN COULTER | IM2717U | |
| Мышь IgG1 изотипа контрольно-PE | BECKMAN COULTER | A07796 | |
| Мышь IgG1 изотипа контрольно-ECD или PE/Cy5 | BECKMAN COULTER | A07797 A07798 |
Ссылки
- Bonneville, M., O'Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
- Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
- Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
- Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
- Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
- Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
- Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
- Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
- Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
- Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
- Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
- Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
- Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
$\gamma\delta$ Т-клеткиэкспансия золедронатоммононуклеарные клетки периферической кровианализ методом проточной цитометриицентрифугирование в градиенте плотностистимуляция интерлейкином-2антигенпрезентирующие клеткифенотип эффекторных клеток памятивнутриклеточный интерферон-гаммапрепарат клинического класса
