Методическая статья

Простой протокол Chelex для выделения ДНК из Anopheles SPP.

DOI:

10.3791/3281

⸱

9 января 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Malaria Institute at Macha, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Быстрый и доступный способ извлечения паразита малярии качества и векторной ДНК из образцов комаров описано. Опираясь на свойства хелатирующие смолы Chelex, простой метод позволяет генотипирования малярийных паразитов в комара средней кишки и слюнных желез фаз, а также молекулярная идентификация Anopheles Видов-двойников с помощью ПЦР.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндемичные страны все чаще внедряют молекулярные инструменты для эффективного типирования, идентификации и наблюдения против малярийных паразитов и комаров-переносчиков, как неотъемлемую часть своих программ контроля1,2,3,4,5. Для устойчивого внедрения этих точных подходов в оперативные исследования с целью усиления усилий по борьбе с малярией и ее элиминации необходимы простые и доступные методы, требующие экономных реагентов и оборудования6,7,8. Здесь мы представляем простую методику на основе Chelex для извлечения ДНК малярийного паразита и вектора из собранных в полевых условиях образцов комаров.

Мы морфологически идентифицировали 72 Anopheles gambiae sl. из 156 комаров, пойманных аэрозолем пиретрума в спальных комнатах домашних хозяйств в пределах 2000км2 от Института малярии в Маче. После вскрытия для отделения головы и грудной клетки от брюшной полости у всех 72 комаров Anopheles gambiae sl., две секции по отдельности помещали в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и погружали в 20 мкл деионизированной воды. С помощью стерильного наконечника пипетки каждый секцию комара отдельно гомогенизировали до однородной суспензии в деионизированной воде. Из полученного гомогената из каждой секции комаров 10 мкл сохраняли, а остальные 10 мкл переносили в отдельную автоклавную пробирку объемом 1,5 мл. Отдельные аликвоты подвергали экстракции ДНК либо по упрощенному методу Chelex, либо по стандартному протоколу экстракции9,10. Протокол высоливания является так называемым и широко используется, поскольку в нем используются высокие концентрации соли вместо опасных органических растворителей (таких как фенол и хлороформ) на стадии осаждения белка во время экстракции ДНК.

Экстракты использовались в качестве шаблонов для ПЦР-амплификации с использованием праймеров, нацеленных на ген 4-й субъединицы (ND4) митохинамидадендинуклеотиддегидрогеназы членистоногих (NADH) субъединицы 4 (ND4), ПЦР для идентификации родственного вида Anopheles gambiae 10 и вложенную ПЦР для типирования инфекции Plasmodium falciparum 12. Сравнение с помощью ПЦР качества ДНК (ND4) показало 93% чувствительность и 82% специфичность для подхода Chelex по сравнению с установленным протоколом высоливания. Соответствующие значения чувствительности и специфичности составили 100% и 78% соответственно при использовании ПЦР идентификации родственного вида и 92% и 80% соответственно для ПЦР с детекцией P. falciparum. Не было существенных различий в доле образцов, подающих ампликонный сигнал с помощью Chelex или протокола обычного высоливания во всех трех приложениях ПЦР. Подход Chelex требовал трех простых реагентов и 37 минут для завершения, в то время как протокол высоливания включал в себя 10 различных реагентов и время обработки 2 часа 47 минут, включая ночной этап. Наши результаты показывают, что метод Chelex сопоставим с существующим методом экстракции и может быть заменен в качестве простого и устойчивого подхода в условиях ограниченных ресурсов, где часто трудно поддерживать постоянную цепочку поставок реагентов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовительные Препарирование Mosquito Образцы

  1. Место комаров на небольшой резке парафильмом и крепление на рассекает микроскопом.
  2. Крышка в капле деионизированной водой, чтобы смягчить ткань.
  3. Надрезать комаров туши именно в стык между грудной клеткой и животом, таким образом, никующие от головы и грудной клетки от брюшной части.
  4. Передача каждого расчлененный комаров раздел в чистую автоклаве 1,5 мл микроцентрифужных трубки prelabeled с москитной ID номер детали и соответствующие указатели для обозначения секции кузова (например, «М» для средней кишки разделе; "HT" для головы и грудной клетки разделе).
  5. Откажитесь парафильмом и тщательно протрите столик микроскопа с 70% алкоголя, смоченной Kimwipe перед обработкой следующего комаров.

2. Экстракции ДНК из образцов Mosquito

  1. Внесите 20 мкл деионизированной воды в трубку образца и использование пипетки для измельчения подводных комаров раздел в ООНiform подвески.
  2. Добавить 100 мкл из автоклавного 1X PBS / 1% сапонина решение гомогената образца и микс от нежного мгновенного встряхиванием.
  3. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 мин.
  4. Центрифуга при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
  5. Ресуспендируют осадок в 100 мкл 1X PBS.
  6. Центрифуга раз при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
  7. По нежным встряхивания (5 сек), ресуспендируют осадок в 75 мкл стерильной деионизированной воды и 25 мкл 20% вес / объем Chelex-100 смола подвеска в деионизированной воде.
  8. Пирс отверстие в крышке пробирки с использованием стерильной иглой 23G подкожных вспыхнул в горелку.
  9. Кипятите образец подвески на водяной бане с плавающей стойки (или в нагревательный блок) в течение 10 мин.
  10. Центрифуга на 20000 мкг, в течение 1 мин и передачи последующие раствор ДНК в prelabeled флаконе хранение для использования в качестве шаблона в приложениях ПЦР.

3. Plasmodium тропической генотипирования и AnophelesSPP. Молекулярная идентификация

  1. Добавить 2,5 мкл экстракта ДНК Chelex в 25 мкл реакции ПЦР, чтобы проверить качество ДНК 11, выявлению видов Anopheles 10 и генотип P. 12 тропической средней кишки и слюнных желез инфекций.
  2. Чтобы максимизировать доходность ампликона, особенно для P. тропической обнаружения, включают 1.5X бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ПЦР. Следующие реакционной смеси рекомендуется: (2,5 мкл шаблон, 0,25 мкМ праймера, 1,5 мкМ хлорида магния, 200 мкМ дНТФ, 1X ПЦР буфера, 1,5 BSA и 1.0U Taq ДНК-полимеразы, в 25 мкл объема).
  3. Чтобы проверить качество ДНК в экстракте, усиливать области членистоногих митохондриальной дегидрогеназы никотинамид-аденин-динуклеотид (NADH) субъединицы 4 (ND4) гена (праймеры ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 '] и ND4RV [5' СТТ-CGD СТТ против часовой стрелки ADW CGT TC-3 ']; ожидать продукта 400bp) 11,13.
  4. Чтобы отличить Anopheles Гамбииэлектронной SL. видов-двойников (an. gambiae СС и. arabiensis только), усиливают области фланговые SNPs в межгенные прокладку (IGS) области, (праймеры ООН [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; ожидать продукта 390bp gambiae сс, 315bp arabiensis) 10,11.
  5. Для набора P. тропической антифолат полиморфизмов лекарственной устойчивостью, выполнить ПЦР для амплификации области фланговые аминокислотных кодонов 108, 51, 59, 16 и 164 в паразита дигидрофолатредуктазы (DHFR) генов:
    Первичный праймеры тура: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] и M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
    Вторичный круглый праймеров: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] с F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
    Или
    F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] с M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
    Также усиливаются области, содержащей аминокислотных кодонов 436, 437, 540, 581м 613 в P. тропической дигидроптероатсинтазы синтетазы (ДГП) генов:
    Первичный круглый праймеры R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] с R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
    Вторичный круглый праймеры
    J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] с K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
    Или
    K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] с K /,
    Или
    L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] с L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3 »] 12.
  6. Тема 4 мкл ампликонов в аллель-специфических ферментов рестрикции пищеварения в 30 мкл реакции в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, для обнаружения наркотиков антифолат, связанные с резистентностью полиморфизм 12.
  7. Тема 5 мкл ПЦР ампликона (или 15 мкл ограничение дайджест) на полосу бромистого этидия окрашенных 2% агарозном геле для электрофореза (100 - 120В) и визуализации полос в УФ-просвечивания.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примеры результатов ПЦР для комаров качество экстракта ДНК (рис. 1), Anopheles arabiensis молекулярной идентификации (рис. 2) и P. тропической обнаружения (рис. 3) показывает, что упрощенный метод Chelex дает аналогичные результаты в стандартный протокол высаливания 10, несмотря на гораздо меньшее число шагов (табл. 1). При сопоставимом качестве ДНК в соответствующие выдержки это не удивительно, что положительный пример цены по отношению к. gambiae видов-двойников, а также цены паразитарной инфекции не были статистически отличаться в зависимости от теста хи-квадрат McNemar (Рисунок 3).

Чувствительность (%) рассчитывали как TP / (TP + FN) * 100, где TP означает истинно положительных и FN обозначает ложные негативы. Специфичность (%) была определена как TN / (TN + FP) * 100, где TN обозначает истинную негативов и FP обозначает ложных срабатываний. ДНК качества (ND4) ПЦР показал 93% чувствительность и 82% специфичность для Chelex подхода по сравнению с установленными высаливания протокол как золотой стандарт. Соответствующие значения чувствительность и специфичность составили 100% и 78%, соответственно, с использованием идентификации видов-двойников ПЦР и 92% и 80%, соответственно, для P. тропической обнаружения ПЦР.

Кроме того БСА в реакционной смеси в результате общего увеличения положительных ПЦР (рис. 3) в связи с рельефом ПЦР ингибиторов 14, как для упрощенного Chelex и регулярно высаливания протокол. Однако это увеличение не было статистически значимым, за исключением ДНК качества (ND4 ПЦР) на Chelex экстракты (р = 0,039). Аллель конкретные ограничения ферментативного расщепления на P. тропической DHFR (или другого гена-мишени) ампликона позволяет генотипирования средней кишки и слюнных желез заболевания малярией лекарственной устойчивости аллели (рис. 4; слюнных желез данные не показаны).

Простая процедура Chelex Стандартная процедура высаливания
Шаги Реагенты Шаги Реагенты
  1. Добавить образца до 1,5 трубку микроцентрифуге мл и гомогенизируют в 100 мкл 1X PBS / 1% сапонина решение (2 мин.)
  2. Оставить при комнатной температуре в течение 20 мин.
  3. Спиновые при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
  4. Добавить 100 мкл 1X PBS и аккуратно перемешать на мгновение встряхиванием (3 сек.)
  5. Спиновые при 20000 х г в течение 2 минут и отбросить супернатант.
  6. Добавить 25 мкл 20% вес / объем Chelex в деионизированной воды и 75 мкл стерильной деионизированной воды.
  7. Пирс отверстие в крышке пробирки помощью горячей, стерильной иглой 23G подкожных и содержание кипения трубку в течение 10 мин.
  8. Побочные пробирке в 20000 мкг в течение 1 мин.
  9. Передача супернатант в стерильную пробирку и prelabeled решение магазине ДНК при температуре от -20 ° C до использования (2,5 мкл 25 мкл ПЦР).

PBS


Saponin

Chelex-100 бусин

  1. Добавить образца до 1,5 трубку микроцентрифуге мл и гомогенизируют в 100 мкл буфера * Бендер с 1% DEPC (2 мин.)
  2. Инкубировать при 65 ° С в течение 1 часа.
  3. Добавить 15 мкл холодного 8 М ацетата калия. Осторожно перемешать и инкубировать на льду в течение 45 мин.
  4. Побочные образца в микроцентрифуге труб при 20000 х г в течение 10 мин и передачи супернатант в новую 1,5 мл трубки.
  5. Добавить 250 мкл 100% этанола и хорошо перемешать путем обращения трубки.
  6. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Побочные образцов при 20000 х г в течение 15 мин.
  8. Аспирируйте и отбросить супернатант, оставляя осадок полностью высохнуть в трубке (30 мв).
  9. Ресуспендируют гранул в 20 мкл 0,1 X SSC + РНКазы (10 мкг / мл) в течение ночи при 4 ° C.
  10. Добавить 80 мкл DEPC воду и хранят при температуре от -20 ° C до использования.

Диэтилпирокарбонатом (DEPC)
* Бендер буфера:
0,1 М NaCl
0,2 М сахарозы
0,1 М Трис-HCL


0,05 М ЭДТА, рН 9,1


0,5% SDS в воде DEPC

8 М ацетата калия

Этанол

0,1 X Saline цитрат натрия (SSC) буфера

РНКазы (10 мкг / мл)

Общее время: 37 мин Общее время звучания: 2 часа 47 мин, плюс ночь

Таблица 1. Шаг за шагом сравнению реагентов и времени требования к простой протокол Chelex и стоятьARD высаливания метод для выделения ДНК из образцов комаров.

figure-results-1
Рисунок 1. ND4 ПЦР митохондриальной ДНК сравнения качества от упрощенной Chelex "C" и стандартный высаливания "M" экстрактов образцов Anopheles arabiensis поле. NC, отрицательный контроль; M1 и C1, C2 и M2, M3 и C3, и M4 и C4 в паре высаливания и Chelex выдержки из той же. Образцы arabiensis комаров. L, 100 б.п. ДНК лестнице.

figure-results-2
Рисунок 2 Молекулярная идентификация ПЦР для arabiensis Anopheles C1 и M1, M2 и C2, C3 и M3, M4 и C4 обозначают соответствующие ампликона от высаливания "М" и упрощенного Chelex "C" ДНК экстракты для тех же образцов комаров;.. AR, Anopheles arabiensisПоложительный контроль, L, 100 б.п. ДНК лестнице.

figure-results-3
Рисунок 3. Обнаружение срабатываний на Chelex и высаливания ДНК экстракты для комаров образцы поля, с ПЦР для молекулярной идентификации Anopheles arabiensis (AR) 10, членистоногих NADH дегидрогеназы ген 4 (ND4) ДНК-тест качества 11 и антифолат P лекарственной устойчивостью . тропической DHFR генотипирования 12 (F-M4). Результаты показали анализы для запуска с или без BSA в реакционной смеси. Хи-квадрат McNemar был использован для определения различий между процентом положительных ПЦР с ДНК, выделенной из упрощенной Chelex и стандартные высаливания протоколы были статистически значимыми.

figure-results-4
P. тропической инфекции в комаров (средней кишки данных показан) для аллелей лекарственной устойчивостью. BstN Я пищеварения на ампликона фланговые кодон 108 из P. тропической ген DHFR 12 показывает cycloguanil устойчивых мутантов в S108T комаров образцов (M1-M5; средней кишки данные показаны). U, непереваренные 522 б.п. ампликона; FCR3, лабораторных стандартных P. тропической позитивный клон контроль проведения S108T; K1, P. тропической лаборатории стандартных клонов отрицательный контроль проведения cycloguanil чувствительных S108N, L, 100 б.п. ДНК лестнице.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Упрощенный метод Chelex представленные здесь позволяет добыче качества Anopheles SPP и P. тропической ДНК из образцов комаров поддаются разнообразных приложений ПЦР. Эта техника может быть использована для молекулярной идентификации комаров переносчиком малярии и наблюдение за лекарственной устойчивостью P. аллелей в тропической комаров для национальных программ борьбы с малярией. Преимущества упрощенной техникой Chelex включают простоту, меньше реагентов и, следовательно, стоимости, безопасности и короче время обработки (37 мин), чем стандартные протоколы, такие как метод высаливания 10 (2 ч 47 мин и в течение ночи шага, таблица 1). Указанные преимущества и минимальные требования реагента (3 реагентов) по сравнению с текущим стандартным протоколом (10 реагентов, таблица 1) 11,15, сделать упрощенные Chelex протокола особенно дружелюбны к эндемичным лабораториях страны, где постоянно реагентовцепочками поставок часто трудно поддерживать. Ограничение метода является то, что, как стандартный протокол, это было также подлежат ПЦР ингибиторов известно, происходят в организме комара покрова 16. Тем не менее, это легко освобождается от включения BSA в анализах. BSA также успешно использоваться в качестве усиления усилителя с ингибиторами в других приложениях ПЦР 17,18.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность начальников, старост и общин Macha для их unwaveing ​​сотрудничают во комаров коллекции образцов поле. Доктор Дуг Норрис и Ревекка Kent предлагается бесценный опыт на высаливания протокол. Эта работа финансировалась по борьбе с малярией Johns Hopkins научно-исследовательский институт экспериментальной системы грантов. Комар и паразитов ДНК-лаборатория стандартов, любезно подаренных MR4, американский тип и культуры Collection.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Chelex-100, 50-100 сухой сетки BioRad # 143-2832
Saponin SIGMA 142-7425
BSA New England Biolabs B9001S

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54(2007).
  2. Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31(2008).
  3. Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
  4. Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254(2010).
  5. Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410(2009).
  6. Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
  7. Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
  8. Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401(2011).
  9. Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).
  10. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
  11. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
  12. Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
  13. Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
  14. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
  15. Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
  16. Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
  17. Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
  18. Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ChelexAnophelesChelex

Похожие статьи