GENPLAT: Автоматизированная платформа для биомассы Открытие ферментов и коктейль-оптимизации

Краткое содержание

GENPLAT (GLBRC Фермент Platform) представляет собой автоматизированную платформу для обнаружения и оптимизации фермента коктейли для деградации биомассы. Он может быть адаптирован к нескольким сырья и смеси ферментов, содержащих несколько компонентов.

Аннотация

Высокая стоимость ферментов для деструкции биомассы является основным препятствием для экономически эффективного преобразования лигноцеллюлозного сырья в жидкие транспортные топлива, такие как этанол. Нами была разработана интегрированная высокопроизводительная платформа GENPLAT для поиска и разработки новых ферментов и ферментных коктейлей, предназначенных для высвобождения сахаров из различных комбинаций предварительной обработки и биомассы. GENPLAT состоит из четырех элементов: индивидуальных очищенных ферментов, статистического планирования экспериментов, роботизированного дозирования суспензий биомассы и ферментов, а также автоматического колориметрического определения высвобожденных Glc и Xyl. Индивидуальные ферменты производятся путем экспрессии в Pichia pastoris или Trichoderma reesei, либо путем хроматографической очистки из коммерческих коктейлей или экстрактов новых микроорганизмов. Модели смесей на основе симплекс-решетки (дробный факторный план) разрабатываются с использованием коммерческого статистического программного обеспечения для планирования экспериментов. Ферментные смеси высокой сложности создаются с помощью роботизированного дозирования в 96-луночный формат. Измерение высвобожденных Glc и Xyl автоматизировано с помощью ферментных колориметрических анализов. Оптимизированные смеси ферментов, содержащие до 16 компонентов, были протестированы на различных комбинациях сырья и методов предварительной обработки.

GENPLAT может быть адаптирован для использования с mixtures чистых ферментов, смесями коммерческих продуктов (например, Accellerase 1000 и Novozyme 188), экстрактами новых микробов или их комбинациями. Для приготовления и тестирования смесей из ˜10 чистых ферментов требуется менее 100 μg каждого белка и менее 100 реакций в общей сложности при конечной общей нагрузке 15 mg белка/g глюкана. Мы используем ферменты из нескольких источников. Ферменты могут быть очищены из природных источников, таких как культуры грибов (например, Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum и Galerina marginata), или получены путем экспрессии кодирующих генов (полученных из растущего числа последовательностей геномов микробов) в таких хозяевах, как E. coli, Pichia pastoris или нитчатый гриб, такой как T. reesei. Белки также могут быть очищены из коммерческих ферментных коктейлей (например, Multifect Xylanase, Novozyme 188). Все большее количество чистых ферментов, включая гликозилгидролазы, эстеразы, активные в клеточной стенке, протеазы и лиазы, доступны от коммерческих поставщиков, таких как Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com) и PROZOMIX (www.prozomix.com).

Программное обеспечение Design-Expert (Stat-Ease, Inc.) используется для создания симплекс-решеточных планов и анализа ответов (в данном случае — высвобождения Glc и Xyl). Смеси содержат от 4 до 20 компонентов, пропорции которых могут варьироваться от 0 до 100%. Точки анализа обычно включают крайние вершины с достаточным количеством промежуточных точек для создания достоверной модели. В терминологии планирования экспериментов большинство наших исследований являются экспериментами со «смесями», что означает, что сумма всех компонентов соответствует общей фиксированной нагрузке белка (выраженной в mg/g глюкана). Количество смесей в симплекс-решетке зависит как от числа компонентов в смеси, так и от степени полинома (квадратичного или кубического). Например, эксперимент с 6 компонентами потребует 63 отдельных реакций при использовании расширенной специальной кубической модели, способной выявить трехсторонние взаимодействия, тогда как при использовании расширенной квадратичной модели достаточно всего 23 отдельных реакций. Для смесей, содержащих более восьми компонентов, более практичным является квадратичный план эксперимента, и, по нашему опыту, такие модели обычно статистически достоверны.

Все загрузки ферментов выражены в процентах от итоговой общей загрузки (которая в наших экспериментах обычно составляет 15 mg белка/g глюкана). Для «основных» ферментов нижний процентный предел установлен на уровне 5%. Этот предел был получен на основе нашего опыта, согласно которому выходы Glc и/или Xyl были очень низкими, если какой-либо из основных ферментов отсутствовал (0%). Слишком большое количество образцов с очень низким выходом Glc или Xyl приводит к созданию неточных моделей. Установление нижнего предела, в свою очередь, определяет верхний предел. Таким образом, для эксперимента с шестью компонентами, если нижний предел для каждого отдельного компонента установлен на уровне 5%, то верхний предел для каждого отдельного компонента составит 75%. Нижние пределы для всех остальных ферментов, считающихся «вспомогательными», установлены на уровне 0%. Обозначения «основные» и «вспомогательные» в некоторой степени произвольны и будут различаться в зависимости от субстрата, но в наших исследованиях основные ферменты для высвобождения Glc из кукурузных стеблей включают следующие ферменты из T. reesei: CBH1 (также известный как Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1 (Cel7B), BG (β-глюкозидаза), EX3 (эндо-β1,4-ксиланаза, GH10) и BX (β-ксилозидаза).

Протокол

1. Фермент производства

1. Продукция белков в Pichia pastoris путем клонирования соответствующих генов в векторы pPICZ или pPICZα и превращения в П. pastoris. Рост клеток в 300-мл партий в тупик 500-мл колбы с метанолом индукции каждые 24 ч (Банерджи и соавт., 2010a).
2. Концентрат и опреснения культуры фильтратов по тангенциальной фильтрации потока.
3. Магазин ферменты в небольших порции в 20% глицерине при -80 ° C. Диапазон концентраций составляет 1-10 мг / мл.

2. Планирование эксперимента

1. Введите число ферментов, чтобы быть проверены, их верхние и нижние пропорции (например, меньшая доля в размере 5% для основных ферментов), и тип экспериментального проектирования (например, квадратичной или кубической) в дизайн-Expertsoftware.
2. Рассчитать сумму в мкг каждого фермента, которые будут добавлены, чтобы общая нагрузка от 15 мг / г глюкан, а затем вычислить количество каждого фермента в мкл, чтобы добавить ккаждой реакции.
3. Создание листов Excel указанием источника лабораторного оборудования, источник скважин, назначение лабораторного оборудования, назначение скважин, и передача объемов для дозирования воды и ферментов в соответствии с опытно-конструкторских и импортировать его в программное обеспечение Biomek FXP использованием трансфертного из-файл функции.

3. Ферментативного гидролиза

1. Приостановить биомассы суспензии в 50 мМ цитрат натрия, рН 4,8, содержащий 5 мкг / мл тетрациклина и 5 мкг / мл циклогексимид, в весла водохранилище.
2. Робота пипетки 200 мкл раствора в каждую лунку 96-луночного глубоких скважин пластин реакции с помощью Span-8 1000 мкл пипетки советы с последними 0,5 см отрезать. Смешайте суспензии один раз в 100 мкл / сек, а затем аспирата же объемом от весла водохранилища и обойтись в пластинах.
3. Внесите ферментов в одной тарелке с помощью программы вступил в Beckman FX.
4. Уплотнение пластин с pierceable capmats.
5. Обратить и нажмитепластин несколько раз, чтобы преодолеть поверхностное натяжение. Место пластин при 50 ° С в течение 48 ч в гибридизация инкубатора вращающихся в 10 оборотов в минуту.

4. Определение Glc и XYL

1. Центрифуга реакция пластины в течение 3 мин при 1250 мкг в размахивая ведром центрифуги.
2. Передача 100 мкл надосадочной в обычную 96-луночных использования AP96 стручок Biomek FX.
3. Инкубируйте пластин при 90-95 ° С в течение 10 минут для того, чтобы инактивировать ферменты, а затем центрифуге при 1250 мкг в течение 30 сек.
4. Для измерений Glc, передача 12 мкл супернатанты в регулярные 96-луночных планшетах. Добавить 192 мкл глюкозооксидазы / пероксидаза (GOPOD) реагента. Инкубируйте пластин при 50 ° С в течение 20 минут и прочитать абсорбции при 510 нм в микропланшетного. Бланк является реакционной смеси без каких-либо фермента.
5. Для XYL измерения, передачи 4 мкл в 384-луночных планшетах. Добавить анализа реактивов и читать пластин при 340 нм. Пустойявляется реакционной смеси без каких-либо фермента.

5. Анализ данных

1. Преобразование значения абсорбции их Glc% и XYL урожайности на основе известных Glc и XYL содержимое исходного биомассы. Импорт эти проценты, как ответы на дизайн-эксперт программного обеспечения. Проверка статистических paramenters быть уверены, что критерии для надежной модели выполнены.
2. Подтвердить лучшую модель предсказания экспериментально.

6. Представитель Результаты с GENPLAT:

(1) Создание оптимизированных смесей отдельных чистых белков. Результаты показывают, которых ферменты важны, и в каких пропорциях, а также ферменты, которые не являются важными. Некоторые белки, которые имеются в изобилии в Т. reesei secretome (Nagendran и соавт., 2009), такие как Cip1 и Cip2, как представляется, не играют никакой роли в Glc освобождения из кукурузы Стовер предварительно обработанных аммиаком волокна расширения (AFEX) или щелочных гидравлические Роджен перекись (АХП) (Банерджи и соавт., 2010b). С другой стороны, некоторые белки неожиданно важно. Например, эндо-ксиланазы гликозил семей гидролазы 10 и 11 являются важными для Glc релиз, один ксиланазы не может заменить другие (Банерджи и др., 2010b, с.). Cel61A, незначительных белка в Т. reesei secretome, что очень важно для Glc но не XYL релизе. Некоторые ферменты важны для выпуска как Glc и XYL, тогда как другие необходимы только для одного или другого (Банерджи и соавт., 2010C).

Синтетическая смесь, содержащая 16 компонентов, каждый в концентрации 0,94 мг / мл (то есть, не оптимизированной смеси), выпущенный 38% доступных Glc из-AFEX предварительно DDG. При одинаковых условиях гидролиза, оптимизированная смесь, в которой концентрация 16 компонентов в диапазоне от 0% до 32%, выпущенный 52% Glc (рис. 2). Этот эксперимент показывает, утилита построения определена смесей.

_content "> (2) Создание оптимизированных для различных коктейлей предварительной обработки / субстрат комбинаций. Текущий коммерческих препаратов целлюлозы являются« один размер подходит всем ". На самом деле, лучший коктейль зависит как от субстрата и предварительной обработки. единого продукта таких как Accellerase 1000 дает различные выходы из различных подложках предварительно таким же образом, и от одной подложке подвергаться различным предварительной обработки (рис. 1). Мы использовали GENPLAT для оптимизации смесей чистые ферменты для нескольких предварительной обработки и Mutiple сырья (Банерджи и др. др.., 2010C). Рисунок 2 показывает, как оптимальные пропорции фермента 16 чистых ферментов отличается для AFEX-предварительно кукурузы Стовер, АХП, предварительно обработанные кукуруза Стовер, и AFEX-предварительно DDG. Только 11 ферментов, показаны на рис. 2, так как оптимальное Пропорции другие пять (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 и Cel12A) оказались 0% (Банерджи и соавт., 2010C).

(3) Новый фермент открытие Т. reesei и А. Нигер, выращенных на различных подложках. Один частности экстракт увеличила Glc выход, когда добавлен в наш основной набор. Ответственность белка очищали и показано, что роман гликозил гидролазы нет в любых коммерческих ферментного препарата (Банерджи и Уолтона, неопубликованные результаты).

(4) Открытие лучше ферментов. Показав с GENPLAT которых ферменты являются наиболее важными для деградациичастности биомассы, у нас есть лучшее понимание того, какие ферменты должны быть в центре внимания для улучшения. Лучше примеры критических ферменты могут быть найдены с помощью функции поиска в природе или с помощью белковой инженерии. (Фермент может быть "лучше", чем его Т. reesei гомолога несколькими способами, в зависимости от желаемого имущества, например, более высокую удельную активность, более тесного взаимодействия, снижение протеолитических чувствительности или повышенной термической стабильности). GENPLAT обеспечивает значимые платформой для опробования потенциально лучше ферменты, потому что она использует реально сложный коктейль (не важно, потому что биомасса фермент работает в изоляции) и реалистичной подложки (важно, потому что результаты с чистой целлюлозы или другие искусственные субстраты, не могут иметь отношение к природным лигноцеллюлозных материалов).

(5) Коммерческая оптимизация фермента. Достаточно большое количество чистые ферменты еще не существуют в реальном мире. Пока они не делают, про этанолизводителей должны полагаться на коммерческие продукты, такие как Accellerase 1000 и MultifectXylanase. Тем не менее, смесей промышленных ферментов, как правило, выполняют лучше, чем любой человек один, и GENPLAT может быть использована для разработки оптимизированного коктейли из нескольких коммерческих ферментов. На рисунке 3 показано использование GENPLAT оптимизировать смесь четырех коммерческих ферментных препаратов. Оптимальные пропорции для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG были признаны 47% Accellerase1000, 27% Multifect пектиназа, 22% Novozyme 188, и 4% Multifect ксиланазы (Банерджи и соавт., 2010C). Рис 3B показывает различия в Glc выход из AFEX-DDG с четырьмя ферментных препаратов; оптимизированы коммерческих целях смесь дает более высокий урожай, чем Glc Accellerase1000 один, SpezymeCP в одиночку, или 16-компонентов синтетические смеси. Этот эксперимент также показывает, что 16-компонентов синтетических смесь отсутствует один или несколько ферментов, необходимых для оптимального Glc релиз, в котором присутствуют в одной или нескольких коммерческих ферментов. GENPLAT может быть намред идентифицировать такие компоненты.

Рисунок 1. Ни один из коммерческих ферментного препарата является оптимальной для всех субстратов и все предварительной обработки. Пять субстратов и три предварительной обработки были сравнены в аналогичных условиях шлифовальных (0,5 мм размером частиц), фермент загрузкой (15 мг / г глюкан), гидролизный условия (48 ч, 50 ° С). А. Переваривание различных AFEX-предварительно субстратов с Accellerase 1000. Б. Пищеварение кукурузы Стовер предварительно обработанные с помощью трех различных методов с Accellerase 1000 (см. Банерджи и соавт., 2010C).

Рисунок 2. Оптимальные пропорции 11 ферментов для выпуска Glc из-AFEX предварительно кукурузы Стовер (AFEX-CS), щелочной перекиси водорода, предварительно обработанные кукуруза Стовер (МАИ-CS), или AFEX-предварительно высушенный дистиллироватьERS 'зерна (AFEX-DDG). Данные взяты из Банерджи и соавт. (2010C). Номера в верхней части бары Glc дает в процентах от общего Glc в биомассе образца.

Рисунок 3. A. Использование GENPLAT производить оптимизированные смеси из четырех коммерческих ферментных препаратов для выпуска Glc из-AFEX предварительно DDG. Multifect ксиланазы сделали наименьший вклад (4%) и поэтому исключены из этой тройной диаграмме. Б. Glc урожайности AFEX-DDG с различными лечения фермента при одинаковых условиях гидролиза (15 мг / г глюкан фермента, 48 ч, 50 ° С) . "Четыре-компонента коммерческих" имеет пропорции определяются из эксперимента приведена на рис. 3А.

Обсуждение

Широко признано, что снижение стоимости ферментов важно развитие экономических лигноцеллюлозных промышленность этанола. В настоящее время доступны коммерческие коктейли фермента являются сложными и плохо определены смеси многих белков (Nagendran и соавт., 2009), и они приспособлены в основном для использования на кислотно-предварительно кукурузы Стовер. В целях ускорения разработки более совершенных коктейлей фермент, несколько лабораторий разработали высокой пропускной способности платформ для открытия ферментов и характеристики. Усилия в этой области, включили один или несколько из следующих свойств также в GENPLAT: робот дозирования ферментов и биомассы суспензий, статистический дизайн эксперимента, и / или автоматизированных определения Glc и XYL (Берлин и др., 2007; Decker и др.. др., 2009;. Ким и др., 1998;. Король и др., 2009).. GENPLAT расширяет эти более ранние усилия, что наиболее важно в сложности ферментом смеси, которые могут быть проанализированы с не более 6 компонентов вболее ранние исследования в более чем 16 в нашу последнюю работу (Банерджи и соавт., 2010C). Дополнительные ключевые особенности GENPLAT являются использование бусинка смесительной камеры (лопасть водохранилище), которые могут держать Стовер шламов приостановлены во время отпуска; нежный смешивания в процессе пищеварения до конца по сравнению с аналогичным конце вращения; и автоматизированных колориметрических определения Glu и XYL.

Материалы

Оборудование и программное обеспечение, используемое:

1. Дизайн-Эксперт программное обеспечение, версия 8.0 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, MN) ( http://www.statease.com )
2. Biomek FXP лаборатории автоматизации рабочих станций (Beckman Coulter-, Фуллертон, Калифорния)
3. Biomek FXP программное обеспечение, версия 3.3 (Beckman Coulter-, Фуллертон, Калифорния)
4. Водный резервуар (В. П. Модель 756C-1P100, V & P Научно Inc, Сан-Диего)
5. Плиты, 96-глубокая (1,5 мл) и (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Великобритания)
6. Pierceable capmats (США Научные, Ocala, FL)
7. Вращающийся гибридизация инкубатора (модель 5420, VWR)
8. Размахивая-ведро центрифугу (модели 5810R, Эппендорф, Гамбург, Германия)
9. Плиты, Costar 96-а (Abgene, Fisher Scientific, Epson, Великобритания)
10. Тарелки, 384-а (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Реагенты, применяемые:

1. Pichia pastoris и векторы: напряжение X33, и pPICZ и pPICZα (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния)
2. Т. reesei и векторы: напряжение QM9414 (Министерство сельского хозяйства США Национальный центр сельскохозяйственных исследований использования, Пеория, штат Иллинойс), а pCB1004-EV (Банерджи и др., 2010b).
3. Accellerase 1000 (номер партии 1600844643) (Genencor, Inc, Рочестер, штат Нью-Йорк)
4. 50 мМ цитрат натрия буфере, рН 4,8
5. Тетрациклин складе: 10 мг / мл
6. Циклогексимид складе: 10 мг / мл
7. GOPOD анализа комплекта, каталог K-Gluc (Megazyme, Брей, Ирландия)
8. Ксилозы анализа комплекта, каталог K-ксилозы (Megazyme, Брей, Ирландия)