Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

Tim J. Dumonceaux; Jennifer R. Town; Janet E. Hill; Bonnie L. Chaban; Sean M. Hemmingsen

doi:10.3791/3344

Method Article

Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

DOI:

10.3791/3344

⸱

October 23rd, 2011

Tim J. Dumonceaux¹ , Jennifer R. Town¹ , Janet E. Hill² , Bonnie L. Chaban² , Sean M. Hemmingsen³

¹Saskatoon Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, ²Department of Veterinary Microbiology, University of Saskatchewan , ³Plant Biotechnology Institute, National Research Council of Canada

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем мультиплекс метод обнаружения микроорганизмов в образце с использованием олигонуклеотидных связью флуоресцентные бусы. Ампликона из всех организмов, в пределах образца гибридизации с панели зонда связью бисером. Luminex или Bio-Plex инструмент используется для запроса каждая бусинка для бортовых и гибридизации типа сигнала.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальный вагиноз (БВ) является периодическим полимикробная синдром, который характеризуется изменением в "нормальной" микрофлоры из Lactobacillus доминируют в микробиоты доминируют числа видов бактерий, в том числе Gardnerella влагалищной, Atopobium влагалища и другие ^1-3. Это условие связано с целым рядом негативных последствий для здоровья, включая ВИЧ приобретение ^4, и это может быть трудно управлять клинически ^5. Кроме того, диагноз БВ опирается на использование Грам пятна тампоном влагалищных мазков, которые забили на различные численные критерии ^6,7. Хотя эта диагностическая простой, недорогой и хорошо подходит для ограниченных ресурсов, он может страдать от проблем, связанных с субъективной интерпретации и это не дает подробный профиль состав вагинальной микрофлоры ^8. Последние глубокие усилия секвенирования показали, богатой, разнообразной микрофлоры вагинального счеткие различия между образцов, взятых у людей, которые с диагнозом БВ по сравнению с теми лицами, которые считаются нормальными ^9,10, что привело к выявлению ряда потенциальных мишеней для молекулярной диагностики BV ^11,12. Эти исследования предоставили массу полезной информации, но в глубине секвенирования еще не практичен, как метод диагностики в клинической практике. Мы недавно описанный метод для быстрого профилирования вагинальной микрофлоры в мультиплексе формате с использованием олигонуклеотидных связью люминесцентные бусины с обнаружением на платформе Luminex ^13. Этот метод, как и текущие Граму основе методов, является быстрым и простым, но добавляет дополнительные преимущества использования молекулярного знания, вытекающие из исследования в последовательности зонда дизайна. Этот метод, следовательно, обеспечивает путь к профилю основных микроорганизмов, которые присутствуют в вагинальных мазка, который может быть использован для диагностики БВ с высокой специфичностью и чувствительностью макетared к Граму, обеспечивая при этом дополнительную информацию о наличии видов и изобилие в полуколичественного и быстрым способом. Этот мультиплекс метод может быть расширен за пределы диапазона текущей количественной ПЦР для отдельных организмов, которые в настоящее время ограничивается 5 или 6 различных анализов в одном образце ^14. Важно отметить, что метод не ограничивается обнаружение бактерий в мазках вагинального и может быть легко адаптирована к быстро профиля практически любого микробного сообщества, представляющих интерес. Например, недавно мы начали применять эту методологию для разработки диагностических инструментов для использования в очистных сооружениях.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Dumonceaux и соавт. J. Clin. 47. Microbiol, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Схема изображением общей процедуры представлен на рисунке 1.

1. Бусы связи

Это описывает методы, которые будут использоваться для связи олигонуклеотидных зондов для полистирола Luminex бисером (см. таблицу 2). Объемы приспособлены немного для оценки новых зондов захвата на экспериментальной основе; эти объемы указаны в скобках.

Удаление 1-этил-3-(3-dimethylamiopropyl) карбодиимида HCl (EDC) порошок от -20 ° C эксикаторе....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Специфику генерации сигнала имеет решающее значение, вы должны быть уверены, что сигнал, наблюдаемый действительно отражает обнаружения ампликона генерируется из этого организма. Программное обеспечение таких как PrimerPlex (Премьер Biosoft) может помочь разработать зондов, которые будут скрещиваться эффективно, но они могут или не могут пересекать-гибридизации на нецелевые виды. Когда универсальных праймеров ПЦР используются, как описано в данном протоколе, важно иметь в виду, что ампликона порожденных представляет все.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Альберто Северини и Ванесса Goleski за помощь в развитии анализа и критических комментариев к этой рукописи. Эта работа была профинансирована Агентством общественного здравоохранения Канады и Промышленная программа содействия исследованиям (National Research Council Канады). Дополнительная поддержка была получена из Университета Фонда Публикации Саскачеван.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Олигонуклеотидов имя	Компания	Последовательность ¹
H279BP	Invitrogen, IDT, или другие	Биотин-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Биотин-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
^1O, фосфоротиоатные-C, E, фосфоротиоатные-G, F, фосфоротиоатные-, я, инозин, Y, C или T, R, или G, K, T и G, S, C и G.

Таблица 1. Последовательности модифицированных олигонуклеотидов для универсального cpn60 ПЦР.

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
1-этил-3-(3-dimethylamiopropyl) карбодиимида HCl (EDC)	Прокалывать	22980
Флуоресцентные бисера полистирола: MicroPlex микросфер (Luminex), или Bio-Plex COOH Бусы (Bio-Rad)	Luminex или Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx где ххх соответствует шарик идентификатор	Магнитные гранулы становятся доступными для олигонуклеотида связи и может предложить определенные преимущества. Не было осуждено этих авторов.
Захват олигонуклеотидов (5 'аминокислот С12 модифицированный)	Invitrogen, IDT, или другие	различный	Обессоленная уровня чистоты является приемлемым. Последовательности захвата зонда используется для характеристики мазки из влагалища, которые представлены в рукописи, на которых этот протокол основан ^13.
T7экзонуклеазная	New England Biolabs	M0263S
Стрептавидин-R-фикоэритрин (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Будьте осторожны, чтобы получить высокую чистоту SA-PE, это номер по каталогу рекомендуется
Гильзы 96-ПЦР пластины	Рыболов	CS006509	вписывается в оба 96-луночного амплификаторе и Биоплексы машины
Гильза уплотнения мат	Рыболов	CS006555	Может быть повторно использованы; промыть мыльной водой, хорошо промыть, и сухой
5M ТЦМВ	Сигма	T3411
Bio-Plex или Luminex инструмент	Bio-Rad или Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex программного обеспечения для проектирования зонд	Премьер Biosoft	www.premierbiosoft.com	Предлагаемые для Luminex зонд-де-знак, хотя и другие программные платформы могут быть использованы

Таблица 2. Конкретные реактивов и оборудования.

компонент	мкл / анализ	μl/100 анализов	Конечная концентрация
10x ПЦР буфер (Invitrogen)	5	500	1x
50 мМ MgCl ₂ (Invitrogen)	2,5	250	2,5 мМ
10 мМ дНТФ	1	100	0,2 мМ каждого
H279BP, 25 мкМ	0,25	25	375 нМ
H1612BP, 25 мкМ	0,75	75	125 нМ
H280, 25 мкМ	0,25	25	375 нМ
H1613,25 мкМ	0,75	75	125 нМ
Воды	34	3400	---
Итого	44,5	4450

Таблица 3. Предлагаемые смеси для ПЦР с модифицированными cpn60 UT праймеров (табл. 1). Анализ настроен на 5 мкл ДНК-матрицы и 0,5 мкл (2.5U) из Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen). Обычно большие объемы готовы (например, достаточном для 100 анализов) и хранили при температуре -20 ° C.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

In This Article

Summary

Abstract

Protocol

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles