Хронический Сужение седалищного нерва и боль Гиперчувствительность тестирования у крыс

Summary

Благодаря простоте операции и надежный поведенческий результат, хроническая сжатия седалищного нерва является одним из самых выдающихся животных моделях нейропатической боли. В течение 24 часов после операции, боль гиперчувствительности установлена ​​и может быть количественно измерена с помощью фон Фрей aesthesiometer (механических испытаний) и подошвенные метр обезболивания (тепловых испытаний).

Abstract

Хроническая нейропатическая боль, возникающая в результате повреждения центральной или периферической нервной системы, является распространенным и изнурительным заболеванием, поражающим 7-18% населения^1,2. Симптомы включают спонтанную (покалывание, жжение, похожее на поражение электрическим током) боль, дисестезию, парестезию, аллодинию (боль, возникающую в результате обычно безболезненных раздражителей) и гипералгезию (повышенную реакцию на болевые раздражители). Сенсорные симптомы сочетаются с поведенческими нарушениями, такими как бессонница и депрессия. Для изучения хронической нейропатической боли было разработано несколько животных моделей, имитирующих повреждение периферических нервов, одной из наиболее широко используемых является односторонняя травма хронического сужения седалищного нерва (ЧМТ) Bennett and Xie (1988^). Здесь мы представляем метод проведения ЧМТ и тестирования болевой гиперчувствительности.

CCI проводится под анестезией, при этом седалищный нерв с одной стороны обнажается путем разреза кожи и разрезания соединительной ткани между поверхностной ягодичной мышцей и двуглавой мышцей бедра. Четыре хромированные кишечные лигатуры свободно завязываются вокруг седалищного нерва с интервалом в 1 мм, чтобы только окклюзировать, но не останавливать эпиневральный кровоток. Рана закрывается швами в мышце и скобами на коже. Затем животному дают восстановиться после операции в течение 24 часов, прежде чем начнется тестирование на болевую гиперчувствительность.

Для поведенческого тестирования крыс помещают в испытательный аппарат и позволяют привыкнуть к процедуре тестирования. Исследуемой областью является среднеподошвенная поверхность задней лапы (Рисунок 2), которая попадает в зону распределения седалищного нерва. Механический порог изъятия оценивается путем механической стимуляции как поврежденных, так и неповрежденных задних лап с помощью электронного динамического подошвенного эстезиометра фон Фрея или ручного волоса фон Фрея⁴. Механический порог отрыва — это максимальное давление (в граммах), которое вызывает отведение лапы. Для измерения латентности отвода тепла, впервые описанной Hargreaves et al (1988), задняя лапа подвергается воздействию луча лучистого тепла через прозрачную стеклянную поверхность с помощью подошвенного анальгезиального измерителя^5,6. Латентность отведения к тепловому стимулу регистрируется как время отведения лапы как у поврежденных, так и у неповрежденных задних лап. После ЧМТ порог механической абстиненции, а также латентность термического абстиненции в поврежденной лапе значительно снижаются по сравнению с исходными измерениями и неповрежденной лапой (Рисунок 3). Модель повреждения периферических нервов в сочетании с тестом на гиперчувствительность к боли обеспечивает модельную систему для исследования эффективности потенциальных терапевтических агентов для модификации хронической нейропатической боли. В нашей лаборатории мы используем ЧМТ наряду с термической и механической чувствительностью задних лап для изучения роли нейроиммунных взаимодействий в патогенезе и лечении нейропатической боли.

Protocol

1. Седалищного нерва Хронический Сужение

Асептические методы должны быть использованы для хирургического вмешательства. Лечить хирургического рабочую поверхность на 70% этанола и заранее подготовить стерильные инструменты (например, штраф ножницы, щипцы, и втягивающим), сетки, скобы и тампоны в автоклаве. Для нескольких операций, очистки и resterilise инструментов с 70% этанола или сухой шарик стерилизатор между крысами. Хирургические маски, волосы капот и стерильные перчатки.

Для сжатия нерва, подготовка шва хромовой кишечника, сокращая его на мелкие кусочки около 3 см в длину погружения в стерильный физиологический раствор, чтобы предотвратить высыхание. Для закрытия раны, использовать имеющиеся в стерильных нитей шелка.

1. Обезболить крысы в индукционной камере с использованием 5% изофлуран в O _2, затем доставить на 2% в ИФ O ₂ по заказу маску, и следить за anesthetised животных во время процедуры. Общие анестетики альтернатива в виде ингаляций галотан или внутрибрюшинного пентобарбитала натрия. Кетамин, как N-метил-D-аспартата (NMDA) рецепторов, следует избегать, так как эти рецепторы играют важную роль в развитии нейропатической боли.
2. Бритье левую заднюю ногу крысы. Затем поместите животное на термо-регулируемым нагревательного мата при 37 ° С и применяют мазь смазочных офтальмологических для глаз.
3. Стерилизовать побрился области три альтернативных приложений на 70% изопропиловый спирт и раствор йода.
4. С крыса лежала на его груди / грудной клетки, поднять левую заднюю ногу и удерживайте позицию femor под углом 90 ° к позвоночнику использованием клейкой ленты на ноги.
5. Сделайте надрез в коже параллельно, но 3-4 мм ниже femor и свободной кожи с мышцами вокруг разреза на проходящем через соединительную ткань.
6. Использование тупые ножницы, разрезать соединительной ткани между ягодичной superficialis и бицепсыбедра мышцы.
7. Используйте втягивающего к увеличению разрыва между двумя мышцами, что позволяет четкой визуализации седалищного нерва.
8. Использование изогнутых тупым наконечником щипцы и микро-ножницы, аккуратно бесплатно около 10 мм седалищного нерва (проксимальнее седалищного трифуркации) из окружающей соединительной ткани.
9. Под микроскопом и хороший источник света, связать четыре лигатуры (хромовой кишки 4.0, Ethicon, США) с двойным узлом, 1 мм друг от друга, проксимальнее трифуркации седалищного нерва. Для каждого лигатуры, начните с одного свободную петлю, затем схватить двух концах близко к петле и затяните до петли едва уютно и лигатуры не скользит вдоль нерва. Для проведения цикла в правильном положении, поместите вторую петлю на верхней части первой завершить узел. Наконец, обрежьте свободные концы лигатуры около 1 мм. Сжатие нерва должно быть минимальным, и немедленно остановлена, если кратко наблюдается подергивание, чтобы избежать ареста в гоэлектронной эпиневральный кровотока. При перетяжке лигатуры приводит к axotomy и деление (членовредительство), как нежелательные побочные эффекты, которые исключают успешного тестирования чувствительности боли.
10. Используйте швов (Mersilk 5.0, Ethicon), чтобы закрыть слоем мышц и скобы (Autoclip, 9 мм) для крепления кожи. Затем, используя раствор йода (Riodine) для стерилизации ран.
11. Обратите внимание на крыс тесно в период восстановления анестезии, и позволить ему восстановить в отдельную клетку с плоским постельные принадлежности бумаги (не стандартные кровати животноводство), для того, чтобы предотвратить бессознательное животное задыхается.
    Прежде чем дать любую послеоперационного обезболивания следователи должны учитывать тот факт, что может мешать боль тестирования чувствительности. В самом деле, есть доказательства того, что местное применение анестетиков, лидокаин, во время травмы могут изменить развитие нейропатической боли и уменьшает степень гипералгезии в предыдущей недели ^7. Для дальнейшего обсуждения этого мatter см. обзор Беннет и др. ^8.

2. Измерения боль Поведение

1. Ежедневное обращение с крысами в течение нескольких дней перед началом эксперимента рекомендуется для того, чтобы приучить их к крысам обработчик, уменьшить стресс и риск укусов.
2. До поведенческого тестирования, крысы должны быть приучены к процедуре тестирования и животных корпуса. Среда тестирования должна быть спокойной и хорошо контролируется, с постоянной температурой и уровнем влажности, а также осуществляется на том же время каждый день тестирования сессии.
3. Боль тестирования чувствительности должна быть выполнена несколько раз, прежде ТПП (базовый уровень) и в различные моменты времени после того, как ТПП, как хотелось бы.

3. Механическое снятие порога

1. В день тестирования, место крыс в повышенных сетки этажном клетке тестирования за 15-30 минут до измерения снятие порогов, что позволяет клетке разведки и ГруМин прекратить деятельность и крыс, чтобы стать расслабленным и неподвижным.
2. Использование динамического подошвенной фон Фрей aesthesiometer (Ugo Basile, Италия), положение сенсорного стимулятора блок с нитью непосредственно под срединно-подошвенной поверхности hindpaw, избегая металлической сеткой, а затем нажмите клавишу пуска. Это поднимает нити механически стимулировать подошвенной поверхности hindpaw с нарастающей силой.

Руководство фон Фрей волосы серии увеличением диаметра нити, калиброванный, чтобы вызвать определенный силы при нанесении на кожу. Они могут использоваться как альтернатива электронным динамический подошвенной фон Фрей aesthesiometer для измерения лапу снятие порога, как описано выше ^4. Есть также несколько альтернативных производителей электронных фон Фрей aesthesiometers (например, СИТИ, США и Somedic, Швеция).

3. Запись механического порога выхода из обоих раненых и неповрежденной hindpaWS, в уравновешенной порядке. Это устройство оказывает давление на лапу и на выход реакции системы автоматически записывает и отображает максимальное усилие, приложенное (в граммах). Если неоднозначный отклик происходит (например, в случае ходьбе или уход), повторять стимул и записывать порог снова. Лизание или сотрясение стимуляции следующий hindpaw является признаком поведения, связанного с болью.
4. Повторите механической стимуляции в 3 раза с интервалом около 5 минут между стимулами, запись порогов, а затем вычислить среднее порогов лапу вывод.

4. Тепловая задержка вывода

Инфракрасный (ИК) тепла интенсивность подошвенной инструмент тест должны быть скорректированы до начала эксперимента. В нашей лаборатории мы регулируем ИК интенсивности, чтобы дать среднее время ожидания вывода лапы около 10 секунд в наивной крысы, и мы отсечения задержкой в ​​20 секунд, чтобы избежать ткани плотинывозраста в случае неудачи удалить лапу.

1. В день тестирования, место крыс в стеклянную клетку этажном тестирования за 15-30 минут до измерения латентности, что позволяет клетке разведки и уход прекратить деятельность и крыс, чтобы стать расслабленным и неподвижным.
2. Использование тепловой подошвенной инструмент обезболивания (Ugo Basile, Италия), положение инфракрасный источник непосредственно под срединно-подошвенной поверхности hindpaw и нажмите клавишу пуска. Это подвергает подошвенной поверхности hindpaw к балке лучистого тепла через прозрачную поверхность стекла. Существуют также альтернативные производители тепловой подошвенной инструментов обезболивания (например СИТИ, США и Stoelting, США).
3. Запишите вывод задержка с обоих раненых и неповрежденной hindpaws, в уравновешенной порядке. Это устройство автоматически фиксирует время (в секундах) от начала тепловой стимул для вывода лапы от источника тепла. Если неоднозначный отклик происходит (например, в случае ambulaТион или уход), повторять стимул и записать задержки снова. Лизание или сотрясение стимуляции следующий hindpaw является признаком поведения, связанного с болью.
4. Повторите тепло стимуляции по крайней мере 3 раза с интервалом в 5 минут между стимулами, записать задержки, а затем вычислить среднее задержки вывода лапу.

4. Представитель Результаты

Примером механической порог вывода и тепловой задержки вывода в ипсилатеральной (раненых) и контралатеральной (неповрежденную) лапы крыс Вистар показано ранее (базовый) и 2-12 дней после ТПП в 3А, 3Б и рис. Из этих цифр видно, что Торгово-промышленная палата приводит к значительному сокращению как механические пороги вывода и тепловой задержки вывода ипсилатерального hindpaw, указывающие на наличие механической и термической чувствительности боли, как признаки хронической нейропатической боли .

Рисунок 1. Схема иллюстрирующая расположение лигатуры в модели ТПП. Это животное модель нейропатической боли включает в себя размещение четырех свободных хромовой кишки лигатуры на седалищный нерв, в середине бедра уровне. Это приводит к ранены только часть афферентов собирается стопы и последующей боли гиперчувствительности hindpaw.

Рисунок 2. Схема hindpaw площадь, используемая для болью тестирования. В середине подошвенной поверхности только на задние сапоги, о чем свидетельствует красная пунктирная окружность, используется для тестирования боль. Эта область иннервируется основном конечные ветви седалищного нерва. Пятки и подушечек лап следует избегать из-за дифференциальной чувствительности кожи.

3.jpg "/>
Рисунок 3. Боль гиперчувствительности после хронического сжатия седалищного нерва у крыс. После того, как Торгово-промышленная палата, есть значительное снижение лапу порог вывода на механические раздражители (A) и подушечки вывод задержки тепловых раздражителей (B) в поврежденном (ипсилатерального) hindpaw по сравнению с неповрежденной (контралатеральной) hindpaw (P <0,01 повторных измерений 2 -дисперсионного анализа). Данные показывают среднее ± SEM, п = 7 крыс Вистар.

Discussion

Торгово-промышленная палата является широко используемой модели периферического нерва хронической нейропатической боли. Это относительно простая для выполнения, а также производит надежные и стабильные боль гиперчувствительности, по крайней мере одного месяца после травмы. После ТПП, крысы обладают ненормальное положение потерпевшего hindpaw (пальцы удерживаются вместе и согнуты подошвенные, и лапа выворачивается), а также повторные встряхивания, охраны и лизать потерпевшего hindpaw предположить наличие спонтанной боли ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Хромовой кишки	Ethicon	G-211	4-0 толщиной
Изофлюран	Delvet Пти ООО, Seven Hills, NSW	н / д
Mersilk	Ethicon	W-580	5-0 толщиной
Autoclip	Becton Dickinson	427631	9 мм из нержавеющей стали
Riodine	Орион	R1000802F	1% вес / объем йода
Тепловая подошвенной инструмент обезболивания	Ugo Basile	37370
Динамический подошвенной aesthesiometer	Уго ВасилийE	37400