Изоляция LacZ экспрессирующие клетки из тканей мышей Внутреннее ухо использованием проточной цитометрии

Краткое содержание

Проточная цитометрия - это мощный инструмент, позволяющий выделять и изучать конкретные клеточные популяции. В этом протоколе описаны этапы выделения LacZ-экспрессирующих клеток из тканей улитки неонатальных трансгенных мышей. Диссоциированные кохлеарные клетки мечали с помощью флуоресцентно-конъюгированных субстратов β-галактозидазы перед разделением с помощью проточной цитометрии.

Аннотация

Выделение конкретных типов клеток позволяет анализировать редкие клеточные популяции, такие как стволовые/прогениторные клетки. Такой подход к изучению тканей внутреннего уха представляет собой уникальную задачу из-за нехватки интересующих клеток и небольшого количества трансгенных моделей мышей-репортеров. Здесь мы описываем протокол с использованием флуоресцентно-конъюгированных зондов для селективного мечения LacZ-положительных клеток из неонатальных улиток.

Наиболее распространенной патологией, лежащей в основе сенсоневральной тугоухости, является необратимое повреждение и потеря кохлеарных сенсорных волосковых клеток, которые необходимы для преобразования звуковых волн в нервные импульсы. Последние данные свидетельствуют о том, что слуховые и вестибулярные органы мышей содержат стволовые/прогениторные клетки, которые могут обладать регенеративным потенциалом^1,2. Эти результаты требуют дальнейшего изучения, включая выявление конкретных типов клеток с характеристиками стволовых/прогениторных клеток. Было продемонстрировано, что сигнальный путь Wnt играет решающую роль в поддержании популяций стволовых/прогениторных клеток в нескольких системах органов^3-7. Недавно мы идентифицировали Wnt-чувствительные клетки, экспрессирующие Axin2 в улитке новорожденных, но их функция в значительной степени неизвестна⁸.

Чтобы лучше понять поведение этих Wnt-чувствительных клеток in vitro, мы разработали метод выделения Axin2-экспрессирующих клеток из улиток мышей-репортеров Axin2-LacZ⁹. Используя проточную цитометрию для выделения Axin2-LacZ положительных клеток из неонатальных улиток, мы, в свою очередь, смогли провести ряд экспериментов на живых клетках, чтобы изучить их поведение в качестве стволовых/прогениторных клеток. Здесь мы подробно описываем этапы микродиссекции улитки новорожденных, диссоциации этих тканей, мечения LacZ-положительных клеток с помощью флуорогенного субстрата и сортировки клеток. Описаны методы диссоциации улитки на одиночные клетки и выделения кохлеарных клеток с помощью проточной цитометрии^2,10-12. Мы внесли изменения в эти методы, чтобы создать новый протокол для выделения LacZ-экспрессирующих клеток из неонатальной улитки.

Протокол

1. Микродиссекция улитки

1. Подготовьте микроскоп для препарирования под колпаком, протерев поверхности 70% этанолом и выложив ледяные блоки.
2. Приготовьте 10-15 чашек Петри 35 мм в стерильных условиях и заполните наполовину (~2 мл) стерильным раствором сбалансированной соли Хэнка с кальцием (HBSS).
3. Приготовьте две чашки Петри диаметром 35 мм в стерильных условиях и заполните наполовину (~2 мл) стерильным 1x фосфатным буферным раствором (PBS).
4. Стерилизовать микрощипцы в конической трубке Falcon объемом 50 мл с содержанием этанола 70%.
5. В отдельной комнате от стерильного капюшона с помощью ножниц радужной оболочки глаза обезглавьте 12-15 постнатальных (P) 0-3-дневных мышей-репортеров Axin2^LacZ/+ и поместите головы на 60-миллиметровую чашку Петри на ледяной глыбе.
6. С помощью щипцов Дюмона #5 и ножниц для радужной оболочки глаза иссеките нижнюю челюсть и язык и разрежьте основание черепа на уровне нёба.
7. Удалите вышележащую кожу кальварии и пересеките основание черепа, вставив ножницы в нижнюю часть большого затылочного отверстия до середины нёба.
8. Сделайте еще один надрез ножницами для радужной оболочки от среза неба до верхней части черепной кости с обеих сторон, стараясь не повредить глазную капсулу.
9. Полная изоляция височной кости путем выполнения двух разрезов под углом 45 градусов, начиная с верхней части большого затылочного отверстия и заканчивая корональным разрезом на твердом небе.
10. Поместите изолированные височные кости в 35-миллиметровые чашки Петри, содержащие HBSS, на ледяную глыбу.
11. Соберите височные кости примерно 12-15 животных, которые были принесены в жертву, всего 24-30 височных костей.
12. Переложите чашку Петри с изолированными височными костями в заранее подготовленный стерильный капюшон для вскрытия (1.1).
13. Переложите по четыре височные кости в каждую заранее подготовленную 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую HBSS (1.2) и положите на ледяную глыбу.
14. Начните микродиссекцию с помощью двух щипцов #55, чтобы аккуратно удалить кору, ствол мозга и мозжечок в височной кости, расположенной над глазной капсулой.
15. Не удаляя глазную капсулу, откалывайте части кохлеарной капсулы, начиная от входа вестибулокоохлеарного нерва в глазную капсулу.
16. После обнажения основания улитки аккуратно вытяните улитку и окружающие ткани. Удалите оставшийся спиральный ганглий и сосудистую полоску, начинающуюся у основания.
17. Перенесите улитку в 35 мм чашку Петри, содержащую PBS, на ледяную глыбу.
18. Для оптимальной жизнеспособности тканей общее время диссекции должно составлять менее 60 минут.
19. Повторите описанные выше шаги для 3-5 мышей дикого типа (WT) P0-P3 в качестве контрольной группы для мышей Axin2-LacZ.

2. Диссоциация клеток (модифицированная из ранее описанных методов)^2,10

1. Поместите 50 мкл стерильного PBS в центр лунки в 6-луночную чашку для культивирования, не покрытую покрытием.
2. Перенесите до 20 улиток Axin2^LacZ/+ в каждую каплю PBS объемом 50 мкл. Новая капля PBS объемом 50 мкл должна быть использована для более чем 20 улиток.
3. Предварительно подогрейте 50 мкл аликвот 0,125% трипсина в течение ~2 минут на водяной бане при температуре 37°C.
4. Добавьте 50 мкл предварительно подогретого 0,125% трипсина в PBS, содержащую улитки.
5. Поставьте 6-луночную тарелку при температуре 37°C на 8 минут, стараясь не трясти блюдо.
6. Чтобы прекратить трипсинизацию, добавьте 50 мкл ингибитора трипсина сои в каждую каплю объемом 100 мкл.
7. Добавьте еще 50 мкл полной среды (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ампициллин в DMEM/F12)²
8. Используя тупой наконечник для дозатора объемом 300 μл с пипеточным аппаратом p200, установленным на 125 μл, осторожно растирайте клетки 80 раз, стараясь не создавать пузырьков.
9. После растирания каждой капли добавьте еще 200 мкл FM в каждую лунку.
10. Пропустите ячейки через синий сетчатый фильтр Falcon размером 40 мкм в новую лунку.
11. Переложите ячейки в стандартные пробирки Falcon FACS (после растирания и фильтрации остается около 300 μл).
    1. Разделите клетки улиток дикого типа на три пробирки, разбавив 100 мкл с 300 мкл FM в каждой пробирке. Одна пробирка будет использована в качестве пустого контроля, другая будет окрашена только йодидом пропидия (PI, 1 мкг/мл) (не добавляется на этом этапе), а последняя будет окрашена 3-карбоксиумбеллиферилом β-D-галактопиранозидом (CUG, см. 2.15) для обнаружения фоновой флуоресценции.
    2. Поместите 400 мкл диссоциированных клеток из улиток Axin2-LacZ в каждую пробирку FACS. В качестве контрольной группы разбавьте 10 мкл клеток в 390 мкл FM (см. пробирку F в шаге 2.15). Доведите объем оставшихся пробирок до 400 мкл.
12. Инкубируйте клетки в инкубаторе с влажной температурой 37°C в течение 10 минут.
13. Приготовьте раствор КУГ:
    1. Приготовьте 200 мкл CUG для каждой пробирки FACS, требующей окрашивания.
    2. Разводить CUG в FM 1:50 в темной бленде с минимальной световой экспозицией.
    3. Предварительно разогрейте разведенный CUG при 37°C в течение 3-5 минут.
14. Затем добавьте 200 мкл разбавленного CUG в каждую подходящую пробирку FACS. Для ламп, не предназначенных для CUG, добавьте только FM (см. 2.15).
15. На этом этапе должно быть пять категорий пробирок со следующим содержимым (не добавляйте PI на этом этапе):
    1. Wildtype - без CUG или PI (компенсацию см. на шаге 3.5-6)
    2. Wildtype - только с PI (за компенсацию)
    3. Wildtype - с CUG и PI (для контроля против клеток Axin2-LacZ)
    4. Axin2-LacZ - только с CUG (для компенсации)
    5. Axin2-LacZ - с CUG и PI (для фактической сортировки клеток)
    6. Axin2-LacZ - с CUG и PI (для анализа событий)
16. Защитите все пробирки от света и инкубируйте их в инкубаторе с влажной температурой 37°C в течение 25 минут.
17. Приготовьте свежий раствор HEPES + Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) для остановки реакции после инкубации:
    1. Разведите 400 мкл свежеразмороженного FBS в 10 мл стерильного 10 мМ HEPES (in PBS) в пробирке Falcon объемом 15 мл.
    2. Поместите трубку на лед до конца 2.16.
18. Добавьте 1,8 мл ледяного раствора HEPES в каждую пробирку FACS под стерильным колпаком с выключенным светом, чтобы свести к минимуму воздействие света.
19. Центрифугируйте ячейки при 1200 об/мин в течение 5 минут.
20. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 300 мкл FM, объедините все аликвоты для сортировки образца (Axin2-LacZ, окрашенный CUG и PI).
21. Добавьте PI в каждую пробирку для достижения конечной концентрации 1 мкг/мл.
22. Поместите клетки на лед и защищайте от света.

3. Проточная цитометрия

1. Мы используем BD Aria II, оснащенный лазерами с длиной волны 488, 633 нм и 407 нм. Обнаружение CUG проводилось с помощью фиолетового лазера с длиной волны 407 нм, а PI — с помощью синего лазера с длиной волны 488 нм в Стэнфордском центре FACS.
2. Требуется обученный оператор проточного цитометра. Переходите к следующему этапу после прогрева лазеров, калибровки детекторов цитометра в соответствии с инструкциями производителя и установки оптимальных параметров сортировки. По нашему опыту, мы обнаружили, что использование сопла 100 мкм оптимизирует жизнеспособность клеток для последующих экспериментов.
3. Использовались следующие параметры: пороговое значение при 5 000 событий, расход менее 3 000 событий в секунду, прямое рассеяние (FSC) при напряжении 125 вольт и боковое рассеяние (SSC) при напряжении 250 вольт, для PI использовался канал PE-Cy5, а для CUG — Cascade Blue.
4. Промойте цитометрическую камеру 70% этанолом и PBS дважды в указанном порядке.
5. Начните анализ с неокрашенных клеток дикого типа (пробирка А в шаге 2.15). Соберите 1 000 событий для определения распределения ячеек на графике FSC и SSC. Если разброс не желателен, то отрегулируйте параметры FSC и SSC.
6. Выполните компенсацию с использованием неокрашенных элементов WT (трубка A), окрашенных PI WT (трубка B) и окрашенных CUG элементов Axin2-LacZ (трубка D). Компенсация позволит более точно различать сигнал между различными длинами волн лазера.
7. Начните анализ с PI- и CUG-окрашенных клеток дикого типа (трубка C) и установите параметры стробирования для:
   1. Исключение мусора на основе графика FSC и SSC.
   2. Исключение дублетов и комков с помощью графика FSC-высоты в сравнении с FSC-площадью.
   3. Исключение мертвых клеток на основе графика FSC-области в сравнении с PE-Cy5-областью.
   4. Задайте график между FSC-зоной и Cascade Blue-зоной при любом размещении ворот.
8. Затем проанализируйте 10 000 событий из пробирки с образцом сортировки, содержащей окрашенные клетки Axin2-LacZ PI и CUG (пробирка F).
   1. Здесь должны быть применены все вентили, установленные с использованием ячеек wildtype.
   2. Используя графики для ячеек wildtype, создайте вентили для ячеек Cascade Blue-high, которые составляют менее 1% от общего числа событий.
   3. Эти же затворы Cascade Blue-high теперь охватывают примерно 15-20% клеток в образце Axin2-LacZ, что делает эти клетки Axin2-high.
   4. Используя график анализа клеток Axin2-LacZ, создайте ворота для наименее флюорогенных 15-20% клеток, в дальнейшем с низким содержанием клеток Axin2.
9. Основываясь на вышеупомянутой стратегии стробирования, отсортируйте ячейки в пробирки FACS, содержащие 500 мкл FM, одну пробирку для элементов Axin2-high, а другую для элементов Axin2-low. Во время сортировки убедитесь, что пробирки для сбора находятся в камере, охлажденной до 4°C.
10. Рекордное количество клеток подсчитывается проточным цитометром для каждой популяции.

4. Репрезентативные результаты (см. Рисунок 2):

С помощью приведенного выше протокола мы обычно восстанавливаем 40-45% свободных от мусора клеток как у дикого типа, так и у улиток Axin2^LacZ/+ (рисунки 2A и B), причем около 70% из них свободны от дублетов (см. рисунки 2A' и B'). Большинство отсортированных клеток жизнеспособны и не поглощают PI (~95%) (рисунки 2A'' и B''). В среднем, верхние ~20% CUG-положительных клеток считаются Axin2-LacZ-положительными клетками (Рисунок 2B''') и коррелируют примерно с 15 000 клеток с высоким содержанием Axin2-LacZ на 10-12 животных.

Анализ повторной сортировки клеток с высоким содержанием Axin2 с помощью проточной цитометрии показал чистоту более 93% в канале Cascade Blue. Для дальнейшего подтверждения идентичности этих клеток мы провели постсортное иммуноокрашивание клеток Axin2-high и Axin2-low с использованием антител против β-галактозидазы и обнаружили, что клетки Axin2-high содержат ~93,4% β-галактозидазоположительных клеток (более 1500 проанализированных клеток), а клетки Axin2-low содержат ~4,8% β-галактозидазоположительных клеток.

Рисунки и таблицы:

Рисунок 1.Экспериментальная парадигма. На приведенном выше рисунке показана общая стратегия и методы эксперимента, описанные в разделе протокола. Улитки от мышей дикого типа и Axin2^LacZ/+ собирают и диссоциируют на отдельные клетки, которые затем обрабатывают CUG, флуоресцентным субстратом для β-галактозидазы. Затем с помощью проточной цитометрии были выделены клетки Axin2-LacZ-high и -low. Нажмите здесь, чтобы просмотреть полноразмерную версию этого изображения.

Рисунок 2.Стратегии стробирования. На этом рисунке показаны используемые стратегии стробирования проточной цитометрии. А) Диссоциированные клетки дикого типа, подвергшиеся той же обработке, что и клетки Axin2-LacZ, анализируются здесь с использованием в общей сложности 10 000 событий. На первой панели показана область бокового рассеяния (SSC-A) в сравнении с областью прямого рассеяния (FSC-A). Здесь определенная группа событий имеет гораздо больший размер, чем события, расположенные ближе к оси y. Эти события обозначаются как «Негатив обломков». Следующий вентиль, A', анализирует ячейки "Debris Negative" с панели A, что составляет 43,8% от общего числа событий (см. таблицу ниже). На этой панели высота прямого рассеяния (FSC-H) по отношению к FSC-A используется для исключения дублетов. Исключаются события, отклоняющиеся от ожидаемого линейного характера сюжета. Этот препарат обычно дает ~70% событий в пределах назначенного вентиля, а остальные ячейки исключаются. На панели A'', йодид пропидия (PI), обнаруживаемый каналом PE-Cy5, используется для маркировки мертвых клеток (5,3%). На следующей панели (A''') синий канал Cascade используется для обнаружения флуоресцентной подложки CUG. Здесь на ворота LacZ-high приходится менее 1% от общего числа событий. Б) Диссоциированные клетки мышей Axin2-LacZ, получавших CUG и PI, анализируются здесь с использованием в общей сложности 10 000 событий. Здесь применены идентичные ворота из панели А. B' показывает, что 29,5% клеток исключены как дублеты, в то время как B'' демонстрирует, что 5,4% нежизнеспособны. Начальные вентили для ячеек LacZ-high и -low рисуются с помощью панели B'''', при этом LacZ-high изначально установлен на уровне 19,7%, а LacZ-low — на уровне 20,4%. Нажмите здесь, чтобы просмотреть полноразмерную версию этого изображения.

		Номер мероприятия	процент
a	Анализ вайлдтипов	10 000
А'	Мусор Негатив	4 381	43.80%
А''	Дуплет Негатив	3 116	71,10%
А'''	PI Отрицательный	2 951	94.70%
	LacZ-высокий	16	0,54%
	LacZ-низкий	2 790	94.50%
В	Анализ Axin2-LacZ	10 000
В'	Мусор Негатив	4 218	42,2%
В''	Дуплет Негатив	2 973	70.50%
В'''	PI Отрицательный	2 813	94,6%
	LacZ-высокий	553	19,70%
	LacZ-низкий	573	20.40%

Таблица 1. Количественный анализ стратегий стробирования на рисунке 2.

Обсуждение

Независимые исследования показали ограниченную регенеративную способность неонатальных улиток^2,10,12,13. Используя мышей-репортеров GFP и проточную цитометрию, Уайт и его коллеги выделили специфические клетки поддержки улитки и обнаружили, что они^{обладают характеристиками} клеток-предшественников.

Было продемонстрировано, что канонический путь Wnt маркирует популяции стволовых/прогениторных клеток в нескольких системах органов, включая мозг, молочную железу, кроветворную с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка Петри, полистирол, стерильная Geriner Bio-one 35 x 10 мм <>	VWR international	82050-540 <>
БД Ситечки для клеток Falcon, стерильные, BD Biosciences, синие, 40 шт; m VWR	international	21008-949
Hanks' Сбалансированный солевой раствор (HBSS). Раствор с кальцием, магнием и без фенола красный, стерильный	VWR international	45000-456
Cellstar центрифужные пробирки, полипропилен, стерильный, greiner bio-one, 50 мл	VWR international	82050-346
Cellstar центрифужные пробирки, полипропилен, стерильный, greiner bio-one, 15 мл VWR	international	82050-278 >
	B-27 Бессывороточная добавка (50x), жидкая	Invitrogen	17504-044
pN-2 Добавка (100x), жидкая	Invitrogen	17502-048
bFGF, фактор роста фибробластов - основной человеческий	Sigma-Aldrich	F0291
ИФР-1, инсулиноподобный фактор роста-1 из мышиной <>	Сигма-Олдрич	I8779<>
EGF, эпидермальный фактор роста человека <>	Сигма-Олдрич	Е9644 <>
Дульбекко' s Модифицированный Eagle' s Средний/Ветчина' s F-12 50/50 Смесь: 1X, с L-глутамином и 15 мМ HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Круглодонные трубки, одноразовые, полистирол, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsin, 0,25% (1X) с ЭДТА 4Na, жидкий	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300 мкл, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Ингибитор трипсина, соевые бобы, очищенные	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40 мкм	BD Biosciences	21008-949
Многолуночные планшеты, полистирол, Greiner Bio-One, необработанные планшеты, 6 лунок	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255