Раскрывающееся кальмодулина-связывающие белки

Краткое содержание

Кальмодулин (CAM) выпадающее анализ является эффективным способом для исследования взаимодействия СаМ с различными белками. Этот метод использует CAM-сефарозе шарики для эффективного и конкретного анализа CAM-связывающих белков. Это является важным инструментом для изучения СаМ сигнализации в функционирование клетки.

Аннотация

Кальций (Ca²⁺) представляет собой ион, имеющий жизненно важное значение для регуляции клеточных функций посредством различных механизмов. Значительная часть Ca²⁺-сигналинга опосредована кальций-связывающим белком, известным как кальмодулин (CaM)^1,2. CaM задействован на нескольких уровнях почти во всех клеточных процессах, включая апоптоз, метаболизм, сокращение гладких мышц, синаптическую пластичность, рост нервных волокон, воспаление и иммунный ответ. Ряд белков помогают регулировать эти пути через взаимодействие с CaM. Многие из этих взаимодействий зависят от конформации CaM, которая существенно различается в связанном с Ca²⁺ состоянии (Ca²⁺-CaM) по сравнению с его свободным от Ca²⁺ состоянием (ApoCaM)³.

В то время как большинство белков-мишеней связываются с Ca²⁺-CaM, некоторые белки связываются только с ApoCaM. Некоторые из них связывают CaM через свой IQ-домен, включая нейромодулин⁴, нейрогранин (Ng)⁵ и некоторые миозины⁶. Было показано, что эти белки играют важную роль в пресинаптической функции⁷, постсинаптической функции⁸ и мышечном сокращении⁹ соответственно. Их способность связывать и высвобождать CaM в отсутствие или присутствии Ca²⁺ имеет решающее значение для их функционирования. Напротив, многие белки связываются только с Ca²⁺-CaM, и это связывание необходимо для их активации. К таким примерам относятся киназа легких цепей миозина¹⁰, Ca²⁺/CaM-зависимые киназы (CaMKs)¹¹ и фосфатазы (например, кальциневрин)¹², а также спектрин-киназа¹³, которые оказывают различные прямые и опосредованные эффекты¹⁴.

Влияние этих белков на клеточные функции часто зависит от их способности связываться с CaM Ca²⁺-зависимым образом. Например, мы исследовали значимость связывания Ng с CaM для синаптической функции и то, как различные мутации влияют на это связывание. Мы создали конструкт Ng с GFP-меткой и специфическими мутациями в IQ-домене, которые изменяли способность Ng связываться с CaM Ca²⁺-зависимым образом. Изучение этих различных мутаций позволило нам получить ценные сведения о важных процессах, участвующих в синаптической функции^8,15. Однако в подобных исследованиях крайне важно продемонстрировать, что мутированные белки обладают ожидаемым измененным сродством к CaM.

В данной работе мы представляем метод анализа способности белков связываться с CaM в присутствии или отсутствии Ca²⁺ на примере CaMKII и Ng. Этот метод представляет собой разновидность аффинной хроматографии, называемую анализом осаждения (pull-down assay) с использованием CaM. В нем применяются сефарозные бусины с иммобилизованным CaM для выявления белков, связывающихся с CaM, и изучения влияния Ca²⁺ на это связывание. Данный подход значительно более эффективен с точки зрения затрат времени и требует меньшего количества белка по сравнению с колоночной хроматографией и другими методами анализа. В совокупности это предоставляет ценный инструмент для исследования Ca²⁺/CaM-сигналинга и белков, взаимодействующих с CaM.

Протокол

См. на рисунке 1 представлена ​​основная схема процедуры, начиная с гомогената. Расчетное время от подготовки клеточные экстракты для вымывания CAM-связанных белков составляет около шести-семи часов.

1. Ткань подготовки

1. Inject органотипической срезах гиппокампа с вирусом, содержащим плазмиду выражения рекомбинантный белок (в данном примере, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченные Ng) и позволяют ткани, чтобы выразить белка в одночасье.
2. Приблизительно от 12 до 18 часов после вирусной инъекции (в зависимости от вирусного время выражение), подготовить для сбора ткани. Добавить 1 мл буфера рассечение (10 мМ глюкозы, 4мм KCl, 26 мм NaHCO3, 233mM сахарозы, 5 мМ MgCl _2, 1 мМ CaCl ₂ и 0,1% фенол-красный, газовые камеры с 5% CO ₂ 95% O ₂₎ в чашке Петри. Передача культурной ткани / вставить в чашку Петри и добавляют 2 мл буфера для вскрытия вставить, чтобы погрузиться ткани.
3. Сборт органотипической гиппокампа ткани (от 5 до 10 ломтиков), аккуратно очищая ткани без вставки мембраны с помощью скальпеля. В частности удаления конкретном регионе интерес (например, СА1) тоже вариант. Передача приостановлено ткани 1,5 мл трубки микроцентрифужных использованием перевернутой пипетки Пастера.
4. Центрифуга образцов при 1500 RCF в течение 1 мин отделить ткани от вскрытия буфера. Осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
5. Для каждого среза используется, добавить от 30 до 60 мкл гомогенизации буфера (150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 7,5, 1 мМ DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL антиболевой, 1μg/mL пепстатина, и 1% Тритон Х -100), чтобы ткани и гомогенизации полностью с пестиком.
6. Для того, чтобы удалить продукты распада клеток, центрифуга оставшегося гомогената при 1100 RCF в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией, избегая при этом загрязнения из гранул.
7. Возьмите 10% супернатант в качестве образца на входе (образец 1). Магазин оставшиеся супернатант на льду во время подготовки CAM-сефарозе шарики для использования в шаге 3.

Примечание: ткани, используемые здесь, органотипической срезах гиппокампа. Тем не менее, можно использовать диссоциированных нейронов или любой другой системы культивирования клеток. В таком случае, начнем с пункта 1.4 после сбора вашей ткани в соответствующей манере.

2. Подготовка шарики для выпадающем

При работе с бисером, очень важно, чтобы спасти бисером и максимизировать эффективность реакции, предотвращая бусы из сушки по бокам трубки. Чтобы это сделать, то лучше, чтобы повернуть трубы на их стороне, что позволяет решению на влажные бусины на стенках трубки, непосредственно перед центрифугированием.

1. Для каждого выпадающего, пипетки 400 мкл взвешенных кальмодулин-сефарозой бусины в 2 мл микроцентрифужных трубка с относительно FLAт-снизу максимально площадь поверхности и взаимодействие своих решений с бисером во время инкубации.
2. Центрифуга бус на 21000 RCF в течение 30 секунд и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером.
3. Для мытья бисером, добавить 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации, содержащие либо 2 мМ CaCl ₂ для тех, которые используются для выпадающем Ca ^{2 +-СаМ} связывающих белков и 2 мМ ЭДТА (известный Са ^{2 +} хелат) для бисера снос ApoCaM связывающих белков. Слегка нажмите на трубке повторно приостанавливать бисером и центрифуге при 1500 RCF в течение 1 мин. Осторожно удалите супернатант аспирацией, убедившись, что не нарушить бисером.

Примечание: Для всех шагов стремление, то рекомендуется использовать пипетки, которая прекрасно открытия (например, советы гель загрузки), чтобы разрешить удаление решение, не снимая бусы.

3. CAM-сефарозе связывания белков

1. Разделите на два супернатант условиях, содержащих равный объем. В зависимости от вашего состояния, добавить соответствующее количество CaCl ₂ или ЭДТА к надосадочной до 2 мм концентрации для каждого.
2. Добавить супернатант, начиная с шага 1,7 до бисер промывали в соответствующие буфера гомогенизации. Слегка нажмите на трубке, чтобы смешаться.
3. Инкубируйте образцы при температуре 4 ° С в течение 3 часов на шейкере. Повторное приостановить бисером каждые 30 минут или около того, чтобы повысить эффективность связывания.
4. Одноразовая пробирка с образцами и бусы в 1500 RCF в течение 3 мин.
5. Возьмите 50 мкл надосадочной в качестве образца несвязанных белков (образец 2) и осторожно удалите оставшиеся супернатант аспирацией и выбросьте.
6. Вымойте бусин в три раза, как описано в пункте 2.3 с 100 мкл соответствующего буфера гомогенизации.

4. Элюирование

1. Добавить 50 мкл элюирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, и 150 мМ NaCl), содержащий противоположные условия (10 мМ CACL ₂ или 10 мМ ЭДТА) на бусы. Например, образцы, которые были связаны гомогенизируют и в буфере, содержащем Ca ^{2 +} вымываются в элюции буфера, содержащего ЭДТА и наоборот.

Дополнительно: Потепление элюции буфера до 37 ° С перед добавлением бисера может повысить урожайность.

2. Инкубируйте решение бисером при комнатной температуре в течение 30 минут на шейкере. Смешайте бисер аккуратным постукиванием трубки примерно каждые 5 мин.
3. Центрифуга бус на 1500 RCF в течение 3 мин и осторожно удалите 50 мкл надосадочной для связанного белка (образец 3) стремлением. Убедитесь в том, чтобы не потревожить бисером.
4. Добавить буфера белка загрузки всех образцов (т.е. гомогената, несвязанных и связанных белков, а также тех, кто еще связан с бисером).

Примечание: Для обеспечения максимальной элюирования (особенно в случае неэффективного элюирования), добавить 50 мкл соответствующего буфера элюирования (например, добавление ЭДТА содержащих буферефер, чтобы бусины связаны в CaCl _2), чтобы бисер перед нагреванием образцов, чтобы помочь элюировать оставшиеся белком и повторить шаги, описанные в 4.3, чтобы удалить остатки связанных белков.

5. SDS-PAGE и Вестерн-блот

Поведение SDS-PAGE и анализировать использование западных пятно с помощью зондирования для белок и зонд для белок, известный связывать СаМ в противоположном состоянии, положительного контроля.

6. Представитель Результаты

Рисунок 2B показывает пример CAM-выпадающем анализа тестирования обязательные веб-камера GFP с метками Ng по сравнению с эндогенным Ng. Чтобы сделать это, GFP-Нг был избыточно экспрессируется в нашей органотипической срезах гиппокампа в ночное время и ткани гомогенизировали. Гомогенат инкубировали с CAM-сефарозе бусины в присутствии либо Ca ^{2 +} или ЭДТА. Гомогената вход показывает, что GFP-Ng была выражена в дополнение к эндогенным Нг и Са ^{2 +} / CAM-зависимой киназы II(CaMKII). Как и ожидалось на основе известных связывание эндогенного Нг (показано на рис. 2A), GFP с метками Ng элюировали в отсутствие Са ^{2 +} (ЭДТА связанного белка) и несвязанного в присутствии ионов Са ^{2 +} (рис. 2В) . В отличие от контроля, CaMKII, элюировали только в присутствии ионов Са ^{2 +} (белком) и несвязанных в его отсутствие (ЭДТА). Это показывает, что СаМ шарики функционирует нормально, и elutions были эффективными. Самое главное, это показывает, что GFP-Ng связывается с ApoCaM в аналогии с эндогенной форме, предполагая, что теги GFP не изменило функции нашего рекомбинантного белка.

Рисунок 1. Очерк СаМ выпадающего анализа
(А) гомогената ткани вращается вниз, чтобы удалить продукты распада клеток. Около 10% надосадочной взят как образец мощность (1). Остальные супернатант делится поровну на различныхусловий и соответствующих реагентов (CaCl ₂ или ЭДТА) добавляются в тест обязательным в таких условиях. Каждый супернатант (содержащие либо CaCl ₂ или ЭДТА) загружается на соответственно подготовленных CAM-сефарозе бисером и (Б) инкубировали чтобы обязательными. Свободные белки удаляются (2) и (C) связанных белков (3), элюировали из бисера использованием элюирующего буфера (EB), содержащий противоположное условие, как обязательные. Белкового состава этих трех образцов белка могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блот анализа.

Рисунок 2. A.) Схема Ca ^{2 +-зависимый} СаМ обязательными и элюирования в выпадающем Примеры анализа даны два типа белков, которые связываются камеры в Ca ^{2 +-зависимым} образом. Neurogranin (Ng) представляет собой белки, которые связываются апо-CAM и CaMKII представляет белков, которые связываются с Са ^{2 +-богатых}CAM. СаМ показана в ее состоянием диссоциации до инкубации с гомогената белков. После инкубировали в условиях высоких Са ^{2 +} концентраций (2 мм) или в присутствии Са ^{2 +} хелатором, ЭДТА (2 мМ), белки связываются с СаМ соответственно. Ng связывает камеры в условиях ЭДТА как там практически нет Са ^{2 +} подарок, и будет элюировали CAM-сефарозе бусин в присутствии ионов Са ^{2 +.} CaMKII, однако, будет связываться с камеры в наличии большое количество Са ^{2 +} и будет отделить один раз Са ^{2 +} был хелатные.
Б) Результаты Например СаМ выпадающего анализа. Эта цифра демонстрирует ожидаемый конечный результат CAM-сефарозе тянуть вниз образцы исследовали на Нг и CaMKII. Оба эндогенных Нг и GFP-Ng присутствуют в полосы белки, которые связываются СаМ в присутствии ЭДТА. Нет Нг обязан, когда образцы инкубировали с камеры в присутствии ионов Са ^{2 +,} демонстрируя, что Nг только связывает апо-CAM. Наш положительный контроль, CaMKII, с другой стороны, связывает СаМ только в присутствии ионов Са ^{2 +.}

Обсуждение

При условии, протокол использует CAM-сефарозе бусин для расследования Ca ^{2 +-зависимость} CAM-связывающих белков. Многие белки связываются камеры в Ca ^{2 +-зависимым} образом. Эти взаимодействия имеют большое значение, учитывая количество CAM-связывающих белков и их важную роль во многих сигнальных путей. В этом протоколе, CAM-сефарозе бусин используются для разделения CAM-связывающих белков из гомогената ткани в наличии или отсутствии Ca ^{2 +.} Результаты этой простой подход будет способство...

Материалы

Продукт	Компания	Номер по каталогу	Примечания
Кальмодулин-сефарозой бисером	GE Healthcare	17-0529-01
Анти-альфа CamKII	Sigma-Aldrich	C6974
Анти-neurogranin	Millipore	07-425
Гель Советы Загрузка Пипетируйте	Рыболов	02-707-138	Используйте для аспирации супернатанты
Микроцентрифуга труб (2,0 мл)	Рыболов	05-408-146	Использовать для всех шагов с участием кальмодулин-сефарозой бисером