Быстрый способ проведения иммунной из рыбок данио сердце эмбриональных описано. По сравнению с весь подход иммуноокрашивания гору, этот метод значительно увеличивает проникновение антител, что позволяет получать изображения с высоким разрешением, которые показывают сотовой / субклеточных структур в сердце в течение намного сократить время обработки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Иммуноокрашивание расчлененного данио рерио Эмбриональные сердца
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данио рерио эмбрион становится популярным в модельном позвоночных естественных условиях для изучения развития сердечных и человеческих пороков сердца благодаря своему выгодному эмбриологии и генетики 1,2. Около 100-200 эмбрионов легко доступны каждую неделю от одной пары взрослых рыб. Прозрачные эмбрионы, которые развивают бывшие внутриутробно делают их идеальными для оценки пороки сердца 3. Выражением какого-либо гена можно манипулировать с помощью морфолино технологии или РНК инъекций 4. Более того, вперед генетические экраны уже сформирован список мутантов, которые затрагивают различные перспективы cardiogenesis 5.
Всего иммуноокрашивания крепление важная техника в этой животной модели выявить экспрессии целевого белка в определенной ткани 6. Тем не менее, изображения с высоким разрешением, которые могут раскрыть клеточный или субклеточных структур, было трудно, в основном за счет физических нахоионного сердца и бедных проникновение антител.
Здесь мы представляем метод для решения этих узких мест, анализируя сердца, а затем проводят окрашивание процесс на поверхности стекло микроскопа. Для предотвращения потери небольших образцов сердце и облегчить решение обработки, мы ограничили сердце образцов в круг на поверхности предметные стекла, запряженной immEdge пера. После окрашивания, сигналов флуоресценции можно непосредственно наблюдать соединение микроскопа.
Наш новый метод значительно улучшает проникновение на наличие антител, так как сердце от эмбриональных рыбу только состоит из нескольких слоев клеток. Высокое качество изображения с нетронутыми сердца могут быть получены в значительно снижается процессия время для рыбок данио эмбрионов в возрасте от 2-й день за днем 6. Наш метод может быть потенциально распространяться на другие органы пятно расчлененный либо из рыбок данио или других мелких животных.
Протокол
1. Подготовка слайдов и влажной камере
- Влажной камере могут быть сделаны из окна, такие как опустели наконечник коробки. Оберните обе камеры и накрыть алюминиевой фольгой для защиты образцов от света месте.
- Внутри камеры, поставить кучу мокрой бумажные полотенца для поддержания влажности воздуха внутри камеры, что позволит предотвратить сердце образцы от высыхания. Установите небольшой планшет на вершине бумажное полотенце в качестве стойки для слайдов.
- Ничья либо линии или круги на поверхности стекло микроскопа использованием immEdge перо, чтобы сделать скважины для сердца образцы с диаметром около 5х5 мм. Пусть слайды сухой.
- Положите слайды в увлажненной камере и добавить свежие 50ul 4% формальдегида в каждую лунку.
2. Препарирование эмбрионального сердца
- Обезболить рыбы эмбриона в яйце E3 воды 7, содержащий 0,4% tricaine в течение приблизительно 1 минуты, пока рыба движение тела остановить, но до сих пор нормальное сердцеизбиение.
- Положите вогнутой слайд микроскопа на этапе вскрытия микроскопом. Трансфер эмбрионов вогнутую хорошо.
- Настройте свет сочетание рассекает микроскопом, чтобы четко выявить сердце. В зависимости от личных предпочтений, это может быть либо темном поле или ДВС-поляризованным, как состояние света.
- Чистая два шприца инсулина с 75% этанола, а затем сухой.
- Отрегулируйте рассечение микроскопом, чтобы лупы с большим увеличением и сосредоточиться на сердце. Физически исправить эмбриона, вставив один кончик иглы в желтке сомитов граница близко к голове. Вставьте другую иглу близко к области сердца и вытащить сердце из быстро. Если сердце не полностью отделены от эмбриона, отрезать оставшиеся ткани связаны между сердцем и желток.
- Настройте микроскоп, чтобы меньшее увеличение и сосредоточиться на разделенных сердце. Используйте 10 мкл pipetteman и установите его в 1 мкл объема. Применить кончик pipetteman либо нарисовать или сенсорныйСердце образца, так что изолированное сердце будет либо внутри, либо прикреплены к поверхности наконечника.
- Dip пипетки в 4% раствор формальдегида на подготовленных слайдов и нажмите пипетки поршня, чтобы освободить душу в решение. Натяжение водной поверхности также помогает освободить сердце от кончика пипетки в раствор. Положите менее 3 сердца в каждую лунку.
3. Иммуноокрашивание
- Закрыть камеру и положил его на шейкере со спокойным движением раскачивания. Fix сердца образца в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Вытрите воду на задней слайды и поместить слайды на этапе вскрытия микроскоп для буфера обмена.
- Опустите наконечник от 10 мкл pipetteman в пустую область в каждую лунку и держать кончик как можно дальше от сердца образцов. Возьмите предупреждает, чтобы избежать сердце присоединения к кончику, так как сердце может двигаться с потоком воды, когда раствор втягивается в наконечник. Изменениенаконечник локализации, если это необходимо.
- Утилизировать раствор на ткань и избежать любого производства пузырьков в наконечник с образцом сердце легко теряется при наличии пузырьков воздуха. Хранение образцов сердце частично высохнуть в течение короткого времени может помочь сердца пребывания прилагается к слайдам.
- Добавить 50 мкл PBST для покрытия сердце образца и инкубировать в увлажненной камере в медленное движение качалки в течение 5 мин. Повторите промыть еще раз. После этого шага, сердце образцы могут быть сохранены в увлажненной камере до 1 недели при температуре 4 ° C.
- Блок сердца образца с 10% овечьей сыворотки в PBST в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте сердца образца с первичными антителами, такие как разведение 1:200 β-катенина антител и 1:200 разбавление Mef2 специфических антител, в 10% овечьей сыворотки / PBST в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте сердце образца с PBST в три раза (5 мин. Каждого) при комнатной температуре.
- Инкубируйте образца со среднимантитела, такие как разведение 1:1000 Alexa-меткой анти-мышь и / или анти-кролика антитела, в PBST в течение 0,5 часа.
- Вымойте сердце образцов с PBST в три раза (5 мин. Каждого) при комнатной температуре.
4. Изображений
- Удалить PBST и добавить 10 мкл монтажа среду в каждую лунку. Рок камеры в течение нескольких минут, пока раствор становится ясно.
- Удаление большей части монтажа средних и охватывать все скважин в один слайд с стекло микроскопа крышкой (24x50).
- Изображение рыбы сердца, используя Zeiss Axioplan 2 микроскоп с ApoTome (Carl Zeiss).
5. Представитель Результаты
Пример изображения, которое показывает, мембраны и ядра всех рыбок данио кардиомиоцитов показано на рис. 1. mef2c и β-катенина антитела используются вместе, чтобы пятно сердца образцы расчлененное из 52 эмбрионов данио HPF. Хотя mef2c пятна антител ядер кардиомиоцитов, β-катенинаантител показывает границы каждой ячейки 8-10. Регулируя этап сложного микроскопа, изображение сердца образцов может быть настроен на ту же ориентацию, что позволит наблюдения внешних кривизны и внутренней кривизны в сердце 11. Общее количество кардиомиоцитов, кардиомиоцитов размер ячейки, а округлость может быть измерена.
Другой пример, который показывает саркомерных структуры эмбрионального сердца показана на рис. 2. Мы провели иммуноокрашивания использованием F59, антитела миозин, в расчлененное эмбрионального сердца. Сеть миофибрилл в целом эмбрионального сердца может быть четко выявлены на более низких увеличение, в то время как поперечно-полосатой полоса толстой нити могут быть выявлены при большем увеличении (рис. 2) 6.
Рисунок 1. Иммуноокрашивание из Mef2 (красный) и β-катенина (зеленый), чтобы показать ядер и outlИнес кардиомиоцитов в желудочке рыбок данио. Шкала бар = 10 мкм
Рисунок 2. Immnostaining миозина, чтобы показать толстую нить в данио желудочка при любом малом увеличении () или большим увеличением (B). Шкала бар = 10 мкм
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
По сравнению с классическими методами иммунной целом горе, наш метод имеет следующие преимущества. Во-первых, гораздо сильнее, флуоресцентные сигналы могут быть последовательно получены благодаря улучшению проникновения. В целом метод иммунной горы, плотной ткани кожи вокруг сердца значительно уменьшается проникновение много антител, что приводит к высоким фоном во всем теле. Эта проблема особенно серьезна для эмбрионов старше 3-дневный после оплодотворения (DPF). В противоположность этому, расчлененный сердца состоять ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Beninio Jomok за помощь в данио хозяйства. Эта работа финансируется NIH HL81753.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| tricaine | Исследование органических | 3007T | |
| Формальдегид | Polysciences | 04018 | |
| Инсулин шприц | Becton Dickinson | 329461 | |
| Тритон-Х-100 | Сигма | T8532 | |
| Anti-β-катенина антител | Сигма | C7207 | |
| Анти-Mef2c антител | Санта-Крус-Biotech | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Анти-α-актинина антител | Сигма | A7811 | |
| Анти-Ilk антител | Сотовые сигнализации | # 3862 | |
| Alexa Fluor 568 козьего анти IgG кролика TD> | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa Fluor 488 козьего анти мыши IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Монтаж средой для флуоресценции | Вектор | H-1200 | |
| ImmEdge пера | Вектор | H-4000 | |
| Poly-L-лизин покрытием слайды | Электронная микроскопия наук | 63410-01 | |
| Стекло микроскопа крышкой | Рыболов | 12-543-D | |
| Вогнутую слайды микроскопом | Рыболов | 7-1305-8 | |
| Препарирование микроскопом | Leica MZ95 | ||
| Соединения микроскопом | Zeiss | Axioplan2 | |
| ApoTome | Zeiss |
PBST:
1 х PBS
0,5% Triton-X 100
400 мг Tricaine
97,9 мл DDH 2 O
2,1 мл (1М Трис PH9)
Отрегулируйте рН до 7,0
Ссылки
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E. Muscle: the regulation of myogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 4, 745-751 (1994).
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A. Cadherins and associated proteins. Vivo. 5, 505-513 (1991).
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
