Отслеживание Гипоксическая сигнализации в Encapsulated Агрегаты сотовый

Summary

Метод фото-инкапсуляции клеток в сшитый гидрогель ПЭГ описан. Гипоксическая сигнализации в инкапсулированные мышиной инсулиномы (MIN6) агрегатов отслеживать с помощью флуоресцентного маркера системы. Эта система позволяет серийный изучения клеток в гидрогель эшафот и корреляции гипоксического сигнализации с изменениями в клеточный фенотип.

Abstract

При сахарном диабете 1 типа аутоиммунное разрушение β-клеток поджелудочной железы приводит к потере выработки инсулина и потенциально летальной гипергликемии. В качестве альтернативного варианта лечения экзогенной инъекции инсулина была изучена трансплантация функциональной ткани поджелудочной железы^1,2. Такой подход обещает более естественное, долгосрочное восстановление нормогликемии. Защита донорской ткани от иммунной системы хозяина необходима для предотвращения отторжения, и инкапсуляция является методом, используемым для достижения этой цели.

Биологически полученные материалы, такие как альгинат³ и агароза⁴, были традиционным выбором для строительства капсул, но могут вызывать воспаление или фиброзный разрастание⁵, что может препятствовать транспортировке питательных веществ и кислорода. С другой стороны, синтетические гидрогели на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) не разлагаются, легко функционализируются, доступны с высокой чистотой, имеют контролируемый размер пор и чрезвычайно ^{биосовместимы,6,7,8}. В качестве дополнительного преимущества, гидрогели ПЭГ могут быть быстро образованы в простой реакции фотосшивания, которая не требует применения нефизиологических температур^6,7. Такая процедура описана здесь. В реакции сшивания УФ-деградация фотоинициатора, 1-[4-(2-гидроксиэтокси)-фенил]-2-гидрокси-2-метил-1-пропан-1-она (Irgacure 2959), приводит к образованию свободных радикалов, которые атакуют винилуглерод-углеродные двойные связи диметакрилированного ПЭГ (ПЭГДМ), индуцируя сшивание на концах цепи. Сшивка может быть достигнута в течение 10 минут. Было показано, что гидрогели ПЭГ, сконструированные таким образом, благоприятно поддерживают клетки^7,9, а низкая концентрация фотоинициатора и кратковременное воздействие ультрафиолетового облучения не наносят вреда жизнеспособности и функции инкапсулированной ткани¹⁰. В то время как мы метакрилируем наш PEG с помощью метода, описанного ниже, PEGDM также можно приобрести напрямую у таких поставщиков, как Sigma.

Неотъемлемым последствием инкапсуляции является изоляция клеток от сосудистой сети. Таким образом, поступление питательных веществ, особенно кислорода, уменьшается и ограничивается за счет диффузии. Это снижение доступности кислорода может особенно повлиять на клетки β, чья секреторная функция инсулина сильно зависит от кислорода^11-13. Состав и геометрия капсулы также влияют на скорость диффузии и длину кислорода. Поэтому мы также описываем метод идентификации гипоксических клеток в наших капсулах ПЭГ. Инфицирование клеток рекомбинантным аденовирусом позволяет производить флуоресцентный сигнал при активации внутриклеточных путей, индуцируемых гипоксией (HIF)¹⁴. Поскольку HIF являются первичными регуляторами транскрипционного ответа на гипоксию, они представляют собой идеальный маркер-мишень для обнаружения передачи сигналов гипоксии¹⁵. Такой подход позволяет легко и быстро обнаруживать гипоксические клетки. Вкратце, аденовирус имеет последовательность для красного флуоресцентного белка (Ds Red DR от Clontech) под контролем тримера, реагирующего на гипоксию (HRE). Стабилизация HIF-1 в условиях низкого содержания кислорода будет стимулировать транскрипцию флуоресцентного белка (рис. 1). Дополнительные подробности о создании этого вируса были опубликованы ранее¹⁵. Вирус хранится в 10% глицерине при -80°С в 150 мкл аликвот в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл при концентрации 3,4 х^{10 10} БОЕ/мл.

Предыдущие исследования в нашей лаборатории показали, что клетки MIN6, инкапсулированные в агрегаты, сохраняют свою жизнеспособность в течение 4 недель культивирования в 20% кислорода. Агрегаты MIN6, культивируемые при 2 или 1% кислорода, показали как признаки некротических клеток (все еще около 85-90% жизнеспособности) при окрашивании бромидом этидия, так и морфологические изменения по сравнению с клетками при 20% кислорода. Гладкая сферическая форма агрегатов, отображаемых на 20%, была утрачена, и агрегаты стали больше похожи на неорганизованные группы ячеек. Хотя стресс с низким содержанием кислорода не вызывает выраженного снижения жизнеспособности, он явно влияет на агрегацию и функцию MIN6, что измеряется глюкозостимулированной секрецией инсулина^. Вестерн-блоттинг инкапсулированных клеток с содержанием кислорода 20% и 1% также показал значительное увеличение HIF-1α для клеток, культивируемых в условиях низкого содержания кислорода, что коррелирует с экспрессией белка DsRed DR.

Protocol

1. PEGDM синтеза и фотоактивных PEGDM макромера приготовления раствора

1. Взвесьте 2g ПЭГ (линейный, 10000 Da) в 40 мл флакон стекло с жестким пластиковым колпачком.
2. Добавьте примерно 308μL метакриловой ангидрида и свободно колпачок флакона.
3. Микроволновая флакон на высоко в течение 2 минут в стандартной бытовой микроволновой печи. Ношение теплостойкие перчатки, тщательно вихрь флаконе, то микроволновая печь на высоко в течение еще 5 минут.
4. Кратко позволяют флакон для охлаждения достаточно, чтобы обращаться с перчатками. Открывать его и медленно добавить метиленхлорид в то время как закрученной флаконе. Добавить настолько, что решение представляется ясным и однородной, вортексе образца по мере необходимости. Общий объем метиленхлорид использоваться, должны быть 1,5 - 2 мл.
5. Осадок PEGDM в 200 мл холодной, перемешивают диэтиловый эфир, добавляя по каплям раствор.
6. Сбор PEGDM путем вакуумной фильтрации и дайте ему высохнуть.
7. Растворите в PEGDM достаточное количестводеионизированной воды (как правило, 100 -150 мл).
8. Диализировать решение против деионизованной воде в течение 5 дней у диализных трубок с молекулярной массой отсечки в 1000 Da. Замените воду один раз в день.
9. Алиготе решение в соответствующие контейнеры и заморозить при -80 ° С в течение ночи. Lyophilize решение в течение 4 дней для получения очищенного белого порошка PEGDM. Хранить порошок при температуре 4 ° С, когда он не используется.
10. Чтобы приготовить раствор фотоактивных PEGDM, сначала подготовить 0,5 мас фотоинициатора маточный раствор путем растворения Irgacure 2959 в деионизованной воде. Вихревые решения и хранить его в темноте.
11. Подготовка 10 мас PEGDM% и 0,025% масс Irgacure 2959 решение в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). Vortex полностью, чтобы обеспечить растворение PEGDM. Как правило, мы подготовить 1 мл этого раствора за один раз.
12. Стерилизовать раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм в шприц 1,8 мл трубки микроцентрифужных. Оберните трубки в алюминиевой фольгеи хранят при температуре 4 ° C

2. Культура, инфекции, и агрегации MIN6 клетки

1. MIN6 клетки культивируют в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 7мм глюкозы, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 0,5 мкг / мл amphotercin B во влажной среде при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
2. Чтобы освободить из клетки обрабатываемой поверхности колбы культуры, аспирация среды, промыть ячейки с 37 ° C кальций / магний без HBSS, аспирация HBSS, затем добавить 2 мл 37 ° C трипсина-EDTA решения и позволяют клеткам инкубировать в течение 3 минут.
3. Твердо банку сторону колбы стучать клетки бесплатно, затем добавить 8 мл 37 ° C средних и энергично пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, стараясь не ввести пузыри.
4. Внесите клеток в стерильных 15 мл центрифужную пробирку и выполнять клеток использованием гемоцитометра или другие процедуры подсчета клеток.
5. При подготовке для заражения клеток с производителемВирус сначала необходимо определить общее количество ячеек, которые будут инфицированы и рассчитать объем суспензии вируса, необходимых для достижения желаемого множественности заражения (МВД) (50 до 100 инфекционных частиц на клетку).
6. Развести вируса в HBSS, тщательно pipeting необходимое количество суспензии вируса в предварительно аликвоты объемом HBSS в 1,8 трубки микроцентрифужных мл. 50 мкл HBSS на лунку агрегирования клеток необходимо.
7. Дисперсные клеток pipeting их вверх и вниз в трубки, а затем пипеткой необходимый объем для достижения 400 000 клеток на лунку в лунки 6-луночный планшет культуры подвески.
8. Добавить соответствующий объем разбавленного вируса в каждую лунку для достижения желаемого МВД.
9. Добавить среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1,7 мл.
10. Место пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора. Установить шейкер на низкое значение, так что средний нежно моет вокруг скважин (~ 100 оборотов в минуту). Разрешить клетки агрегацииТе для 24-36 часов. Агрегаты с приблизительным диаметром 75-175 мкм должна быть сформирована.

3. Инкапсуляции клеток в PEGDM

1. Ячейки могут быть воплощен в виде дисперсии (шаг 2.4) или после агрегации (шаг 2.10). С PEGDM гидрогеля предшественником решение жидкость, клетки могут оседает до сшивания и гидрогель образования. Если урегулирование как ожидается, произойдет быстро, например, с более крупными агрегатами, это может быть полезно для получения гидрогеля в два этапа, так что клетки оседают на центральной плоскости геля. Один шаг гидрогеля синтеза процедура подходит для рассеянных клеток показано на рисунке (рис. 2) и двухступенчатая процедура показана, а также (рис. 3) и подробно описаны ниже (3.2-3.9).
2. Создать сосуд, в котором гидрогель будет формироваться за счет сокращения конический наконечник офф 1 мл пластиковый шприц и размещение его в открытом конечном итоге в стойку.
3. Внесите 20 мкл фотоактивных PEGDM такlution в открытый конец шприца на поршень убедившись, что объем покрывает всю поверхность поршня. Отрегулируйте поршень с небольшим шагом для достижения ровной поверхности жидкости.
4. Место пипетки в стойку и положение стойки под УФ-лампы (365 нм, ~ 7 мВт / см ²⁾ в течение примерно 8 минут, чтобы дать для гидрогеля сшивания. За это время подготовки клетки могут быть начаты
5. Внесите том, содержащий необходимое количество клеток / агрегатов в 1,8 трубки микроцентрифужных мл, крышки, и центрифуга трубке при 130 г в течение 5 минут.
6. Использование micropipettor, осторожно удалите СМИ, не нарушая клеточный осадок на кончике трубки. Как сообщил руководитель медиа подходы гранулы, оно может быть полезно использовать более тонкий, 10 мкл кончиком пипетки.
7. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 20 мкл фотоактивных PEGDM решение (использовать широкий рот пипеткой наконечник, если работать с агрегатами) и добавить клеточной суспензии в шприц сверху-йэлектронной ранее сшитый гидрогель части.
8. Expose шприц, чтобы еще 8 минут ультрафиолета для завершения строительства гидрогеля. Когда закончите, клетки должны быть полностью инкапсулируется в цилиндрических гидрогеля (рис. 3).
9. Извлечь гидрогель из шприца и в 1 мл HBSS в скважине 24-луночного планшета кратко мытья гелем. Передача геля 1 мл средства массовой информации в лунку 24-луночного планшета и культуры под требуемым условиям.

4. Гипоксия слежения

1. В любой момент в течение культуру, образ клетки с помощью флуоресцентной микроскопии для отслеживания начала гипоксического сигнализации. В зависимости от того, что вы можете отображаемого изображения в мульти-луночного планшета или передачи гель на предметное стекло микроскопа до размещения на столике микроскопа. Пик возбуждения Ds Красной достигается при 556nm и пик излучения приходится на 586nm. Эмиссия является довольно интенсивным и, таким образом фотообесцвечивания не наблюдаемыеред проблематичным. Временной лаг между началом производства белка и первое обнаружение сигнала составляет примерно 12 часов. Сигнал достаточно конкретным, чтобы выявить отдельные сигнализации клеток, но разрешение может быть недостаточно для определения внутриклеточной локализации сигнала. В сигнализации клетки, сигнал, как правило, наблюдается равномерно по всей цитоплазме. Интенсивность сигнала может также увеличить с расширенной экспозиции к гипоксии, хотя мы еще не полностью определены, если это из-за увеличения экспрессии белка, в целом накопление белка, или задержка созревания белка.

5. Представитель результаты

Типичный пример MIN6 агрегатов инкапсулированных в гидрогель PEG показано на рисунке 4. Сшитый гель будет твердой всему, принимая форму сосуда, в котором реакция была выполнена. Гель с гладкой внешней поверхности предпочтительнее для имплантации, чтобы помочь в предотвращении иностранной валюты телаотклика. В гель, клеточных агрегатов должно быть полностью закрыто в матрице и однородно распределенные для обеспечения лучшего перенос питательных веществ.

Представитель изображений гипоксических сигнализации в MIN6 агрегаты изображенный на рисунке 5. Идентичные MIN6 агрегатов инфицированных вирусом маркер культивировали в любом 20% O ₂ (5а) или 1% O ₂ (5, б) в течение 44 часов до захвата изображения.

Рисунок 1. Схема деятельности нашей гипоксии системы маркеров. Аденовирусные вставки Ds Красной DR гена и вверх по течению HRE промоутера позволяет гипоксия-индуцированный производство флуоресцентного белка под контролем HIF-1.

Рисунок 2. Процедурные схема для пошагового инкапсуляции дисперсных MIN6 клеток в крosslinked PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, рассеяны клетки взвешены в 40μL из макромера решение PEGDM фотоактивных. Это находится в обезглавленной 1 мл шприц и гидрогель образуется при 365 нм УФ-светом через 10-12 минут. После завершения гидрогеля диск удаляется из шприца, промывают и помещают в среду заполненные луночный планшет для инкубации.

Рисунок 3. Процедурные схема для двойного шага инкапсуляция агрегированных MIN6 клеток в сшитый PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, полу-гель прежде создан УФ сшивание 20 мкл макромера фотоактивных PEGDM решение в течение 8 минут. MIN6 агрегатов тщательно взвешенные в дополнительные 20 мкл фотоактивных макромера решение, которое добавляется в верхней части предварительно сформированных полу-гель. Полный геля формируется еще 8 минут ультрафиолетового облучения с агрегатами полностью инкапсулируются в медиальнойплоскости геля.

Рисунок 4. Изображение 40μL гидрогеля под 20-кратным увеличением. MIN6 агрегаты (~ 400 тысяч общего числа клеток) отчетливо видны в гель. Гидрогель диаметром примерно 6 мм (бар = 1 мм).

Рисунок 5. Флуоресцентные гипоксии сигнализации в агрегированном MIN6 клеток в PEGDM гидрогеля. Клетки, которые инкапсулируются и затем помещаются в инкубации при 20% O ₂ в течение 44 часов не отображаются гипоксии сигнализации (), тогда как клетки, которые были инкапсулированные затем инкубировали в 2% O ₂ в течение 44 часов дисплей ясно, повсеместного сигнала. (Бар = 100 мкм) (б).

Discussion

Метод, представленный здесь предлагает быстрый и простой метод для сотовых инкапсуляции в гидрогель ПЭГ с минимальным использованием не-физиологических условиях. ПЭГ представляет собой очень полезный материал для инкапсуляции его биосовместимость и простота модификации. Простое изменение PEG процент в светочувствительный раствор, например, может быть использован для настройки механические свойства, такие как сжатие модулем и транспортные свойства через размером пор. Кроме того, ПЭГ легко модифицируется путем добавления боковых цепей. PEG гидрогели, следовательно, представляют собой как перспективный клинический устройства и гибкую платформу для лабораторного исследования

Метод для слежения за гипоксии в ПЭГ-инкапсулированные клетки также были представлены. Этот метод полезен для простоты гипоксии обнаружения и для избежания необходимости жертвовать клетки интерес. Методика может быть применена к различным типам клеток в различных условиях вносит свой намиefulness широк. Например, гипоксия, как реплика для стволовых дифференцировки клеток могут быть отслежены в стволовых клеточных культур Micromass. Однако этот метод может быть применен только для разгона клеточные системы или системы, в которой рассеяны клетки позже суммируются. Кроме того, обнаружение флуоресцентного сигнала может быть затруднено в большей или плотной ткани.

Materials

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно
ПЭГ	Sigma-Aldrich	309028-500G
Метакриловой ангидрид	Sigma-Aldrich	276 685-100мл
Микроволновая печь	Эмерсон	MW8784SB
Vortexer	Научно Industries	SI-A236
Метиленхлорид	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Диэтиловый эфир	Sigma-Aldrich	346 136-1L
Диализ труб	Спектр	132640
	Лаборатории
Морозилка
Лиофилизатор	Labconco	7670521
Вакуум-насос	Скрываться, не уплатив проигрыша	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Шприц фильтр	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Пользовательские разработки
FBS	ПАА лаборатории	А15-351
Пенициллин-Стрептомицин	Mediatech	30-002-ДИ
Амфотерицин	Mediatech	30-003-CF
Инкубатор	Thermo Scientific	3597	Napco серии 8000 WJ ж / O2 подавления
Трипсин ЭДТА	Mediatech	25-052-ДИ
Орбитальный Шейкер	VWR	12620-926
УФ-лампы	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Имеет два 40 Вт, 365 нм Blacklight синий луковицы УФ
Центрифуга	Эппендорф	5811 000.010 *	* Номер заказа. Модель 5810 R
Микроскоп	Nikon	TI-ND6-PFS	С filterset для 556nm возбуждения / излучения 586nm