$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Строительство Microdrive
Все диски изготавливаются из тех же основных элементов: подвижная часть, которая несет в себе электрод и фиксированная часть, которая крепится к черепу. Идеальный Microdrive позволяет гладко, но достаточно долго, путешествия электрода в несколько небольших шагов, достаточно прочен, чтобы предотвратить случайное движение электрода, легко манипулировать со стороны экспериментатора, не вмешиваясь в поведение животного, небольшие размеры и легкий вес. В результате этих противоречивых требований различных набор дисков различных приложений.
Только 4 части, необходимые для создания нашего основного диска: медь плоскую головку винта, соответствующие гайки, пластиковые моста получают из одного штырьками строки и два пользовательских огранки пластин латуни.
- Перерыв 3-контактный кусок из заголовка
- Аккуратно вытащите центральный контакт.
- Увеличить отверстия путем бурения через него с размером сверла № 55.
- Вырезать-йчитать с помощью крана 00-90.
- Вырежьте две части из латуни пластины.
- Файл края пластины с Dremmel.
- Просверлите отверстие в середине, как части, используя размер сверло # 65.
- Установите диск куски так, что медные листы касаются контактов. Для этого вставьте медный винт через последовательно латунные пластины, резьбовое отверстие штырьками, вторая пластинка меди и гайки. Затяните винт мягко так, что сборка становится стабильной.
- Припой вывода концов медные листы.
- Файл выступающий конец винта.
- Припой гайку с винтом. Будьте осторожны, не припой гайки латунные пластины.
- Проверьте движение диска: повернуть винт по часовой стрелке, чтобы поднять пластиковую моста.
2. Подготовка зонда кремния
Перед установкой датчика на диск, добавить дополнительную изоляцию в области связи зонда для предотвращения cerebrospinal жидкости (ликвора) или влажности от производства коротких замыканий:
- Взвешивание и смешивание компонентов Sylgard эластомера в соотношении 10:1.
- Использование заостренным аппликатором хлопка, применяются Sylgard в верхней части зонда.
- Дайте ему высохнуть в духовку нагревают при температуре 60 ° С в течение 2 часов.
Чтобы гарантировать, что записи сайтов лишены любого мусора, зонд советы должны быть очищены:
- Подготовьте 4% разбавления Contrad моющего средства.
- Пусть зонд замочить в моющих средств на 63 ° C в течение 2 часов.
- Промойте чистящее средство путем погружения зонда неоднократно в дистиллированной воде.
Перед установкой датчика на диске, сопротивление каждой записи сайта должны быть проверены:
- Опустите зонд в 0,9% раствор, и подключить его к импеданс-метра. Если слишком много сайтов записи имеют неправильное сопротивление, повторите шаги 2.4-2.6 или рассмотреть возможность использования различных зонда.Здесь мы используем сопротивление модуля кондиционирования с Фредериком Haer, Co (ФЭК) в сочетании с домашним селектора каналов. Кроме того, по niPOD NeuroNexus, Inc или NanoZ по Neuralynx, Inc позволяет контролировать сопротивление всех зонд каналов одновременно.
3. Нанесение зонда Microdrive
- С помощью лезвия, нарезать канавки в нескольких мостов для создания прочной поверхности.
- Сопоставлять зонд к мосту привода. Эта процедура лучше всего делать под операционным микроскопом, держа диск с зажимом и настройки датчика по микроманипулятор чтобы черенки отлично параллельно с диска винта. Это гарантирует, что во время продвижения по службе, движение зонда черенками в ткани головного мозга без «резки» через него. Точная глубина зонд советы относительно базового привода должна быть определена на данном этапе, принимая во внимание глубину целевой структуры с поверхностичереп.
- Зонд затем крепится к мосту с зажимом цемента.
- Дополнительно: для визуализации зонда след в мозгу, DiI раствор (1-2% растворяется в этаноле) могут быть применены к задней части датчика на данном этапе.
4. Подготовка черепа
До операции, ссылка и наземных электродов и частей на голове клетки Фарадея готовы:
- Отрежьте два 2 "длинные куски медной проволоки, и припаять один конец каждой изолированной медной проволоки около 1 мм.
- С помощью иглы, очистить голову от 00-90, 1/8 "винтом из нержавеющей стали и припаять один кусок медного провода к нему. Пайка таких нержавеющая сталь винт заземления, электроды требует соответствующего потока (например, N-3 Универсальный Поток из Ла-Co) и высокой температуры пайки чаевые. Тщательно предотвращения припой из впадающих в паз винта. Это будет использоваться как основание электрода. Повторите с другой винт и медной проволоки, чтобы подготовитьэлектрода сравнения.
- Вырезать trapeziodal отрывки из медной сетки. Эти части будут собраны для защиты headstage.
Хирургические инструменты и подготовки такие же, как используется во многих небольших операций животным. Вся операция проводится под наркозом глубоко ИФ с использованием асептических условиях, в соответствии с НИЗ утвержденных принципов. Пожалуйста, обратите внимание, что (макет), операции показаны в этом видео только для демонстрационных целей. Для соответствующих целей и видимость съемки, несколько подготовительных шагов, хирургические меры предосторожности и послеоперационные процедуры не показаны / видимыми или обсуждается.
До операции, все компоненты и материалы должны быть стерилизованы, после соответствующих процедур (см. Руководство по выживанию хирургии грызунов; http://oacu.od.nih.gov/ARAC/surguide.pdf). Во время операции, стерильные поля на череп подготовлены и выделены стерильной драпировки. В конце операции, антибиотики широкого спектраpplied локально, так и длительного действия боль убийца внутримышечно (например, бупренорфин, [Buprenex] 0,05 мг / кг). Кроме того, обезболивающее (например, ибупрофен) содержится в питьевой воде около 60 часов mg/kg/24 течение 5 дней. Для правильной хирургической анестезии и процедуры, проконсультироваться с соответствующими источниками 12.
- Установить животных в стереотаксического аппарата, бриться и чистить кожу головы 13.
- Разрежьте кожу вдоль средней линии и отодвинуть кожу головы. Удаление надкостницы, чистой и сухой череп.
- Измерьте местоположение и расстояние между брегмы и лямбда, и определить координаты х и у участка имплантации датчика соответственно помощью стереотаксической атлас 14. Отметьте место, очищая крест на черепе с помощью скальпеля.
- Просверлите черепа с помощью круглой сверло головы (размером ¼) и винты диска поддержки (из нержавеющей стали, 000-120, 1/16 ") на полпути в кости, на разных пластинах кости на вершинея на стороне черепа. Винты обеспечит якорей безопасно связь головной убор к черепу.
- Просверлите отверстия над мозжечком и вставить землю и электродов, подготовленный в шаге 4.2. Для регистрации локальных потенциалов поля (LFP), выбор сайта ссылка имеет решающее значение. Этот сайт выбрана потому, что мозжечковая LFP является самым маленьким из всех областях коры и мышечных артефактов минимально возможным на этом месте средней линии.
- Применение дентина активатора (Metabond комплект) с помощью крошечной кистью по всей поверхности черепа. Промойте его с 0,9% раствором.
- Применение стоматологического цемента (Metabond комплект, следуйте инструкциям производителя для смешивания) на черепе, тщательно покрытие анкерные болты и землю и электродов, но оставляя места имплантации датчика ясно.
- Закрепите четыре медные сетки закрылки (подготовлен в шаге 4.3) к черепу. Для этого цемента узкая база каждого из них на передней, левой, правой и задней сторонах черепа. Thэлектронной медь никогда не должны находиться в прямом контакте с костью, но всегда, разделенных слоем цемента.
5. Подготовка поверхности мозга
- С помощью круглого сверла голову, сверлить вокруг места имплантации в несколько этапов, в то время часто орошения кости с физиологическим раствором.
- Осторожно снимите костный лоскут и орошать поверхность мозга.
- Для установки нескольких голени зонд, большая полоса оболочки удаляется. Два инструмента, необходимого для удаления оболочки: скальпель и крюк получают из насекомых иглы (в качестве альтернативы стандартным микроэлектрода вольфрама). Согните кончике иглы, нажав на твердую поверхность (например, предметное стекло стекло), и приложите его к ручке (здесь, кусок деревянного Q-Tip, наоборот microdissecting иглодержатель).
- Снимите оболочку с крюка, и резать скальпелем. Особое внимание уделяется, чтобы избежать повреждения мягкой, сосудов и поверхности коры головного мозга. Малые кровотечения могут быть решенысоленой орошения. Если кровотечение происходит или коры головного мозга находится под угрозой в любом случае, следует учитывать прекращение операции и подготовку другого животного.
6. Имплантация зонда
На данном этапе, плотность и ориентация коры надводных кораблей тщательно оценены. Стереотаксических координат должны быть скорректированы, так как зонд должен проникнуть в мозг, в зону, свободную от более крупных судов.
Для имплантации, привод сборки могут быть проведены с крокодил прикреплены к стереотаксической владельца. Бесперебойное видимости поверхности мозга и советы зонда имеют решающее значение для успешного проникновения.
- Медленно опустите зонд до примерно 1 мм выше намеченной цели, постоянно орошения трепанация черепа с физиологическим раствором. Для записи неокортекса, зонд советы опускается в коре примерно 0,5 мм и подняли обратно на поверхности.
- Печать трепанация черепа, применяя теплую расплавленную смесь масла воска и парафина с помощью иглы (10-20г воска в 10 мл парафинового масла, нагревают до 65 ° C). Перед нанесением охладить смесь до 30 ° C и проверить плотность. Он должен быть достаточно мягким, чтобы облегчить движение зонда). Для облегчения полного охвата, смесь может быть расплавлен на месте, приближаясь к закаленные воск кончиком микро-cauterizer.
- Прикрепите нижнюю часть диска черепа с рукояткой цемент, будьте осторожны, чтобы оставить гайка свободно вращаться. Это крайне важно, чтобы избежать случайного "поднять" привода на данном этапе, в противном случае датчик может привести к повреждению мозга. После того, как диск крепится к черепу, плавное движение зонда должна быть проверена.
- Цемент разъем части зонда к черепу.
7. Создание на голове клетки Фарадея
- Потяните вверх и собрать закрылки медной сетки в защитный цилиндр вокруг зонда и DRIве. Цилиндра и служит электрический щит от внешних шумов и артефактов, медленно волны, создаваемой заряженными усы в себя животных.
- Отрегулируйте высоту цилиндра срезая излишки материала, поэтому медные сетки на одном уровне с верхней части датчика разъем.
- Припаяйте провода от ведения и землю винты в соответствующие контакты разъема. Кроме пайка соседних закрылки сетки меди вместе, чтобы обеспечить их непрерывность электрической цепи, и припаять провод заземления к медной сетки.
- Нанесите слой сцепления цемента на медной сетки укрепить его и не допустить прямого контакта между металлом и кожей животного. По желанию, нанесите слой эпоксидной смолы для дальнейшего укрепления головные уборы.
- Проверьте движение ходовой винт.
- Крышка в верхней части головного убора с частью вырезанные из резиновых перчаток.
8. Запись в свободно движущихся животных
- После того, как соотели послеоперационного ухода, подключить животных к записи системы с использованием высоких headstage сопротивление и легкие, ультрапластичным многожильного кабеля. Противовес весом головные уборы.
- Проверьте качество записи каждый день в homecage. Положение записи сайтов судят как единица стрельбы узоры и формы местного потенциала области. Опустите зонд постепенно, поворачивая винт небольшими порциями (обычно 1/8 до 1/4 оборота в день, т.е. 35-70 мкм) до целевой структуры будет достигнуто.
9. Представитель Результаты
Электрофизиологические сигналов (локальный потенциал поля и блок деятельности) зависит от структуры и записано текущее поведение животного. На рисунке 1 показаны примеры 32-канальный СА1 гиппокампа записи в то время как крыса изучает открытое поле. Обратите внимание на выдающийся 8 Гц (тета-диапазоне) колебаний локальный потенциал поля при исследовании с вирerimposed пики на несколько черенков и объектов (примеры шипами указывают стрелки). Для анализа активности нейронов устройство, шипы обнаружены и сортируются в единичных экземплярах с использованием кластерного анализа их сигналов 15-16.
Рисунок 1. СА1 гиппокампа записей в себя крыс с помощью 4 х 8 черенки сайтов кремния зонда. Аудиозаписи широкополосных и дискретизации 20 000 Гц, что позволяет изучать как локальное поле потенциальных колебаний (например, "тета" группа 8 Гц ритм) и пики активности нейронов.
Таблица 1. Альтернативы реактивов и оборудования.
