Методическая статья

Измерение пептида транслокации в Большой однослойные везикулы

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3571

⸱

27 января 2012 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, Wellesley College

В этой статье

Краткое содержание

Это детали протокола метод количественной мерой пептид транслокации в крупные однослойные везикулы липидов. Этот метод также дает информацию о скорости перемещения мембраны и может быть использована для идентификации пептидов, которые эффективно и спонтанно крест липидного бислоя.

Аннотация

Существует активный интерес к пептидов, которые легко через клеточные мембраны без помощи рецепторами клеточной мембраны 1. Многие из них называют клеточной проникающих пептидов, которые часто отмечены за их потенциал в качестве вектора доставки лекарств 1-3. Более того, существует растущий интерес к антимикробных пептидов, которые работают не через мембраны литические механизмы 4,5, в особенности тех, которые пересекают мембран бактерий, не причиняя лизиса клеток и убивают клетки, влияя на внутриклеточные процессы 6,7. На самом деле, авторы все чаще указывали на связь между сотовыми-проникающей и антимикробных пептидов 1,8. Четкое представление о процессе перемещения мембраны и отношения между пептидной структуры и ее способность к транслокации требует эффективных, воспроизводимых анализов для транслокации. Несколько групп предложенных методов для измерения перемещения на большие unilamelЛар липидных везикул (БУВ) 9-13. БУВ послужить полезными моделями для бактериальных и эукариотических клеточных мембран и часто используются в пептидных флуоресцентных исследований 14,15. Здесь мы описываем наш применения метода впервые разработана Мацузаки и коллег рассмотреть антимикробные пептиды, такие как magainin и buforin II 16,17. В дополнение к предоставлению наш протокол для этого метода, мы также представляем прямой подход к анализу данных, которая количественно транслокации возможность использования этого теста. Преимущества этой транслокации анализа по сравнению с другими является то, что она имеет потенциал для предоставления информации о скорости перемещения мембраны и не требует добавления флуоресцентной метки, которые могут изменить свойства пептида 18, триптофан-содержащих пептидов. Короче говоря, способность транслокации в липидные пузырьки измеряется как функция энергии Фостер резонансной передачи (FRET) между родной остатков триптофана и гansyl фосфатидилэтаноламина, когда белки, связанные с внешними LUV мембраны (рис. 1). Cell-проникающих пептидов расщепляются, как они сталкиваются с раскованный трипсина инкапсулированные с БУВ, что приводит к отмежевание от LUV мембраны и падение FRET сигнала. Падение FRET сигнала наблюдается translocating пептида значительно больше, чем это наблюдалось за тот же пептид, когда БУВ содержать как трипсина и ингибитора трипсина, или когда пептид, который не спонтанно крест липидные мембраны подвергается трипсина содержащих БУВ. Это изменение флуоресценции обеспечивает прямое количественное пептидных транслокации с течением времени.

Протокол

1. Подготовка Большой однослойные везикулы липидов (БУВ)

  1. Подготовка БУВ в качестве клеточной мембраны имитирует для анализа 19.
  2. Смешайте фосфатидилхолина (ПОФХ, 760,10 г / моль), фосфатидилглицерина (POPG. 770,99 г / моль), 5-dimethylaminonaphthalene-1-сульфонил фосфатидилэтаноламина (DNS-папы, 994,350 г / моль) (Avanti полярных липидов), растворенного в хлороформе в 50 : 45:5 отношение. Как и каждый анализ требует отдельной подготовки как экспериментальной и контрольной БУВ, два флакона липидного торт должен быть готов. 0,376 мг общих липидов (0,188 мг ПОФХ, 0,169 мг POPG и 0,019 мг DNS-папа), как правило, достаточно, чтобы сделать достаточно пузырьки для одного испытания, транслокации.
  3. Испарится хлороформ использованием N 2 потока газа.
  4. Сухой липидного торт 9-14 часов в вакуумном эксикаторе.
  5. Подготовка складе 10 мМ HEPES буферный раствор (10 мМ HEPES, 238,3 г / моль, 45 мМ NaCl, 58,44 г / моль, 1 мМ ЭДТА, 372,24 г / моль рН 7,4). HEPES буфера йORed при 4 ° C.
  6. Подготовка исходного раствора 0,4 ммоль свиного трипсина (23,3 кг / моль) в 10 мМ буфера HEPES подготовлены выше. Трипсин хранится при температуре -20 ° С, а в нашей практике, как правило, не проходят более 2-х циклов замораживания-оттаивания перед использованием.
  7. Подготовка исходного раствора 4,0 ммоль Баумана-Бирка ингибитор трипсина (8 кг / моль) в 10 мМ HEPES буферный раствор и хранить при температуре -20 ° C. В нашем использовании, этот запас пополняется ежемесячно и обычно не проходят более 3-х циклов замораживания / оттаивания, прежде чем это сделано снова.
  8. Развести экспериментальные многослойные везикулы (MLVs) в 0,2 мМ раствора трипсина, добавив равный объем 0,4 мМ трипсина фондовых и 10 мМ буфера HEPES решение сухой торт липидов. Для одной выборки 0,376 мг общих липидов, смеси 150 мкл раствора трипсина и 150 мкл буфера HEPES достаточно.
  9. Развести контроль MLVs в растворе с 0,2 мМ трипсина и 2,0 мМ Баумана-Бирка ингибитор трипсина путем добавления равного объема 0.4 мМ трипсина акций и 4,0 мМ ингибитора трипсина в сушеных торты липидов. Для одной выборки 0,376 мг общих липидов, смеси 150 мкл раствора трипсина и 150 мкл ингибитора трипсина является достаточным.
  10. Передача MLV решений от стеклянных флаконах до 1,7 трубки микроцентрифужных мл.
  11. Тема MLV решений до 5 циклов замораживания / оттаивания в жидком азоте.
  12. Подготовка липидного экструдера (Avanti полярных липидов), поместив две фильтр поддерживает смоченной в буфере HEPES на каждый кусок тефлоновым экструдера. Место nuclepore отслеживать травились мембрану с порами 0,1 мкм (Ватман, Великобритания) в двух тефлоновой части экструдера, и место экструдер части внутрь канистру экструдер металла. Место прокладки пончик за две штуки экструдера перед затягиванием металла верхней части канистры экструдера и поместив его в держатель.
  13. Заполнить свободный объем внутри экструдера с 500 мкл 10 мМ HEPES буфера с помощью 250 мкл стеклянный шприц для предотвращения потери пузырьков образца.
  14. Нагрузка каждого образца MLV в экструдер и нажмите образца через мембрану по крайней мере 21 раз в целях обеспечения единообразного однослойных размер пузырьков. БУВ получаются из следующих экструзии решение MLV.
  15. Магазин БУВ при температуре 4 ° C и употребить в течение 48 часов.

2. Количественная LUV Концентрация

  1. LUV концентрация количественно путем определения общего содержания фосфора в образце 20.
  2. Подготовка 8,9 NH 2 SO 4 в NanoPure воды и хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовка 2,5% вес / объем молибдата аммония VI (588,04 г / моль) раствора в NanoPure воды. Подготовка 10% вес / аскорбиновая кислота (176,1 г / моль) раствора в NanoPure воды. Защитить решение аскорбиновой кислоты из освещенности, покрывая трубку с фольгой. Магазин обоих решений при 4 ° С в течение 2 месяцев.
  4. Подготовка 0,65 мМ фосфатный буферный раствор (однозамещенный безводный фосфат натрия, 120 г / моль).
  5. Подготовка шесть стандартных тубес. Стандарты должны содержать 0,0 мкл, 50 мкл (0,0325 мкмоля), 100 мкл (0,065 мкмоля), 175 мкл (0,114 мкмоля), 250 мкл (0,163 мкмоля), или 350 мкл (0,228 мкмоля) фосфора решение.
  6. Подготовка LUV пробирок с образцами в трех экземплярах. Каждый образец труба должна содержать примерно 0,1 мкмоля из БУВ. Экспериментальные и контроль LUV концентрации должны быть измерены отдельно.
  7. Для исправления для любой сухой соли фосфора в Баумана-Бирка ингибитор порошок, контроль LUV пустые должны быть готовы. Пустой должна содержать тот же объем 0,2 мМ trypsin/2.0 мМ Баумана-Бирка раствор ингибитора, как был помещен в управление LUV пробирку.
  8. Место 450 мкл 8,9 NH 2 SO 4 в каждом из образцов, стандарт, и пустые трубы.
  9. Тепло образцов, стандартов и заготовки для 25 минут при 175-210 ° С в духовке.
  10. Удалите все трубы и дайте им остыть. Добавить 150 мкл 30% H 2 O 2 на каждый из тубес.
  11. Тепло образцов, стандартов и заготовки для 30 минут при температуре 175-210 ° С.
  12. Удалить образцов, стандартов и заготовок из тепла. Если какие-либо решения еще не бесцветный, добавить 50 мкл H 2 O 2 для всех труб и тепло еще в течение 15 минут при 175-210 ° С.
  13. Добавить 3,9 мл NanoPure H 2 O, 0,5 мл аммиачной воды молибдата и 0,5 мл аскорбиновой кислоты раствор в каждую пробирку.
  14. Тепло все пробирки в течение 5-7 минут в кипящей водяной бане.
  15. Измерить абсорбцию каждого стандарта и образца при 820 нм с использованием Agilent 8453 УФ-видимый спектрофотометр. Пробирку, содержащую 0,0 ммоль фосфора должно использоваться в качестве пустой для всех стандартов и экспериментальные образцы LUV. Трубки, содержащей 0,2 мМ trypsin/2.0 мМ Баумана-Бирка ингибитор раствор должен быть использован в качестве пустой для контроля LUV образца.
  16. Линейное поглощение по сравнению с содержанием фосфора стандартной кривой могут быть получены и использованы для вычисления общего phosphОрус содержание и LUV концентрации образцов.

3. Подготовка пептида Решения

  1. Растворите пептида в NanoPure H 2 O. Пептиды, используемые в настоящем анализе, как описано должен содержать один триптофан остатка.
  2. Измерить абсорбцию во пептид раствора при 282 нм в трех экземплярах. Вычислить концентрацию пептида использованием молярного коэффициента экстинкции для триптофана в 5700 М -1 см -1.
  3. Развести пептида в NanoPure воды конечной концентрации 30 мкМ. Хранить при температуре от -20 ° C

4. Количественное транслокации

  1. Подготовка экспериментальных и контрольных образцов в 1,7 мл пробирок микроцентрифужных. Добавьте достаточно БУВ для каждого решения для конечной концентрации 250 мкМ. Добавьте достаточно Баумана-Бирка ингибитор решения, с тем, что ингибитор конечной концентрации в 10 раз больше, чем концентрация трипсина. Добавьте достаточно 10 мМ HEPES буфера принести окончательный объем раствора до 450 мкл.
  2. Место 50 мкл раствор пептида в Starna микро-ячейки флуорометр кварца. Соотношение между БУВ и пептид достаточно высока, чтобы обеспечить, что практически все нетронутым пептидов находятся в непосредственной близости от достаточно дансил группы, чтобы дать FRET сигнал, даже если ни один из них перемещаются в пузырек. Это согласуется с аналогичными FRET наблюдается в контроле условий для пептидов, которые делают и не перемещать в пузырьки.
  3. Добавить экспериментальной или контрольной пробы на пептид раствора в кювете. Это должно привести к конечной концентрации пептида до 3 мкм.
  4. Начало в 25 минутах флуоресцентные эксперимент кинетики сразу же после того экспериментальных или контроля LUV решении, принимая флуоресценцию чтение хотя бы раз в секунду. Установить длины волны возбуждения при 280 нм, длина волны излучения при 525 нм, а температура до 25 ° C. Использование Кэри Затмение флуоресцентный спектрофотометр, мы устанавливаем PMT чувствительность к высоким.

5. Создание количественное соотношение транслокации

  1. Определить начальный флуоресценции (F о), как флуоресценция чтения через пятнадцать секунд сбора данных. В нашем инструменте настройки, мы обнаружили, что первые пятнадцать секунд флуоресценции собранные данные ненадежны из-за смешивания, закрывая камеру с образцом, и других возмущений в системе при добавления образца. Разделить каждую последующую чтении F о получение относительной флуоресценции (F / F 0) в каждой временной точке.
  2. Средняя все относительные флуоресценции показания последней минуте эксперимента для получения окончательного среднего относительной флуоресценции figure-protocol-1 .
  3. Разделить figure-protocol-2 для контроля образцов figure-protocol-3 для экспериментальных образцов для получения окончательного исправления флуоресценции значение.
ле "> 6. представителю Результаты

На рисунке 2 показаны результаты этого теста для представителя пептид, который показал надежную транслокации. Сигнал в этом эксперименте (черная кривая) показывает значительное снижение FRET сигнала с течением времени. Тем не менее, очень важно для контроля за потенциальной потери FRET сигнала из-за неполного ингибирования трипсина или других факторов, не связанных с перемещением способности. С этой целью мы всегда также измерять FRET сигнала между пептида и БУВ, содержащих как трипсина и Баумана-Бирка ингибитор трипсина (серый след, рисунок 2). В наших руках, было важно выполнять этот контроль для каждого пептида каждый раз, когда эксперимент перспективе. Это позволяет нам четко правильным для любых изменений в сигнал по каким-либо различия между липидных везикул препаратов или инструмент шумов, которые могут иметь значение для относительно слабые флуоресцентные сигналы обычно наблюдается при этих концентрациях.

Важность контроля experiment использованием БУВ содержащие ингибитор трипсина подсвечивается данные, показанные на рисунке 3. В этом случае, сигнального пептида снизился на аналогичную сумму, что на рисунке 2 в опытный образец (черная кривая). Тем не менее, контрольная проба показывает более быстрое уменьшение этого пептида, так что его чистая транслокации ниже.

Раздел 5 нашего протокола описывает простой метод для количественного транслокация из этого эксперимента. Высшее отношения транслокации свидетельствуют о том, что пептиды перемещать эффективно; транслокации соотношение для клетки проникают пептида показано на рисунке 2 составляет 1,16, в то время слабо translocating пептиды транслокации отношения ближе к 1. По нашему опыту, стандартная ошибка для трех независимых экспериментов, выполненных с различных препаратов пузырька находится в диапазоне от 0,01 до 0,06.

figure-protocol-4
Рисунок 1. Схема translocatионного анализа. Экспериментальные образцы LUV (А), легированных флуоресцентные дансил папы (черные полосы) и содержат инкапсулированные трипсина (ножницы). Ингибитор трипсина (красный круг) применяется для подавления трипсина вне БУВ. БУВ подвергаются пептид (фиолетовый). Пептиды совместно с LUV мембраны дает FRET сигнала (зеленый), который уменьшается по мере translocting пептидов встречу раскованно внутренних трипсина. Оба трипсина и ингибитора трипсина заключены в управление LUV образцов (B) для измерения уменьшается в FRET сигнал не связанные с перемещением.

figure-protocol-5
Рисунок 2. Представитель данных для клеточной проникающих пептидов. Представителем translocating антимикробной pepide показывает значительное падение FRET сигнала по сравнению с контролем.

figure-protocol-6
Фигура3. Представитель данные, подчеркнув важность контроля. Неполное ингибирование триптического переваривания без translocating пептида приводит к падению FRET сигнала с течением времени и в экспериментальной и контрольной LUV решений. Потому что разница между контрольной и опытной следы сравнительно невелика, этот мутант характеризуется как слабо translocating пептида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, представленные здесь может быть использован для оценки относительного изменения концентрации пептидов внутри и снаружи липидные пузырьки. Эти изменения связаны с перемещением способности. Этот протокол может быть использован для определения клеточного проникающих пептидов с потенциальными в качестве векторов для доставки лекарств. Поскольку интерес к клеточной проникающие пептиды растет, то это будет интересно посмотреть, как методы, которые непосредственно измерить перемещение события разрабатываются и исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Элеонора Флеминг и Джессика Чен за полезные обсуждения. Финансирование было предоставлено Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний (НИЗ-NIAID) Награда R15AI079685 и Research Corporation Коттрелл колледжа науки Award. Дополнительная поддержка студентов была предоставлена ​​Медицинского института Говарда Хьюза и фонда Стейли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
16:0-18:1 PG Avanti полярных липидов 840457C
1:18 Данзил PE Avanti полярных липидов 810330C
16:0-18:1 ПК Avanti полярных липидов 850457C
Свиной трипсин Сигма T-0303
Баумана-Бирка трипсин / ингибитор химотрипсина Сигма T-9777
Мини-экструдер Avanti полярных липидов 610000
Молибдата аммония (пара) Альфа Aesar 10811
L-аскорбиновая кислота Сигма A1417
Перекись водорода, 30% раствор Mallinckrodt химических веществ 5240-05
HEPES Сигма H-3375
NaCl Сигма S-9625
ЭДТА Сигма E5134
NaH 2 PO 4 Сигма S-0751

Ссылки

  1. Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
  2. Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
  3. Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
  4. Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
  5. Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
  6. Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
  7. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
  8. Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
  9. Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
  10. Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
  11. Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
  12. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
  13. Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
  14. Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
  15. Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
  16. Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
  17. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
  18. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
  19. Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
  20. Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
  21. Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи