Method Article

Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

DOI:

10.3791/3599

⸱

May 27th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несколько-Target Трассировка домашнее алгоритм, разработанный для отслеживания индивидуально меченых молекул в мембране живой клетки. Эффективное обнаружение, оценку и отслеживание молекул с течением времени при высокой плотности обеспечивает удобный, комплексный инструмент для исследования наноразмерных динамика мембраны.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нашей целью является получить подробное описание молекулярных процессов, происходящих в клеточных мембранах в различных биологических функций. Мы стремимся характеризующие сложную организацию и динамику плазматической мембраны в одной молекуле уровне, путем разработки аналитических средств, предназначенных для Одночастичные Tracking (SPT) при высокой плотности: Несколько-Target Tracing (МТТ) 1. Одиночных молекул видеомикроскопии, предлагая миллисекунды и разрешение нанометрового 1-11, позволяет детальное представление мембраны организации 12-14, точно отображение дескрипторов, таких как клеточные рецепторы локализация, подвижность, родов или взаимодействий.

Мы вновь SPT, как экспериментально, так и алгоритмически. Экспериментальные аспекты включены оптимизации установки и мечения клеток, с особым акцентом на достижение максимально возможной плотности маркировки, с тем чтобы обеспечить динамический снимок молекулярной динамикии все происходит внутри мембраны. Алгоритмические вопросы, касающиеся каждого шага для восстановления траектории: пики обнаружения, оценки и воссоединения, рассмотрены конкретные инструменты анализа изображений 15,16. Реализация дефляции после обнаружения позволяет спасать пики изначально скрыты от соседних, более сильные пики. Следует отметить, что улучшение обнаружения непосредственно влияет на повторное, на сокращение разрыва в траектории. Выступления были оценены с использованием метода Монте-Карло для маркировки различной плотности и шум значения, которые обычно представляют собой два основных ограничения на параллельных измерений при высокой пространственно-временной разрешение.

Нанометрового точность 17 получены отдельные молекулы, используя либо последовательного включения / выключения photoswitching и нелинейной оптике, могут обеспечить исчерпывающую наблюдений. Это является основой наноскопия 17 таких методов, как STORM 18 PALM 19,20, 21 или RESOLFT Стед 22,23, бееч. часто требуют фиксированных изображений образцов. Главной задачей является выявление и оценка дифракционного пика, исходящих из одной молекулы. Таким образом, обеспечение надлежащего предположения, такие как обработка постоянная точность позиционирования, а броуновское движение, МТТ прямо подходит для наноскопических анализа. Кроме того, МТТ может принципиально быть использован на любом уровне: не только для молекул, но и для клеток или животных, например. Таким образом, МТТ является мощным алгоритм слежения, что находит применение в молекулярной и клеточной масштабах.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео мы представляем полный одном эксперименте отслеживания частиц, с помощью квантовых точек, ориентированных на конкретные рецепторы мембраны. Основная цель этого эксперимента заключается в дискриминационной различных типов молекулярных поведения диффузии измеряли в плазме мембраны живых клеток. Более того, молекулярные движения, возникающие на мембране как правило, может отличаться от броуновской диффузии, будучи линейно направленный или заключены в нанодоменов 26-29, например. Мы стремимся одновременно как после многих рецепторов, технически это возможно, дают представление о многообразии возникающих в динамике происходящих в мембране живой кле....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В одночастичной слежения, рядом с клеткой и микроскопии аспекты, анализ представляет собой значительную часть работы. Это решает алгоритм, используемый для выполнения трех основных задач: выявление, оценка и снова пики над каждым кадром. Но последующее аспектом этой работы заключается в разработке алгоритма себя, что, возможно, придется адаптироваться к любой новой выделенной расследования, в основном для последнего, дополнительные меры (например, расшифровка режимов движения, взаимодействия или стехиометрии).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов нашей команды, в частности, MC Блаш для оказания технической помощи, а также M Irla и B Imhof, за их поддержку и плодотворные обсуждения. Данные по дефляции и удержания воспроизводится любезность природы методы. Проект осуществляется при поддержке институциональных грантов из CNRS, INSERM и Марсель университета, а также конкретных грантов из региона Прованс-Альпы-Кот-d'Azur, Национальный институт рака дю, Agence Nationale-де-ла Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, 2010 ANR Блан 1214 01) и Фонд застывания La Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). ВР поддерживает общение с Ligue Nationale Рак Contre ле.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Реагент Компания Номер по каталогу Количество
Потому-7 клеточной линии ATCC CRL-1651 5000 клеток / лунку
HBSS без Са 2 + GIBCO 14175 1 мл
0,05% Трипсин EDTA GIBCO 25300 1 мл
8-а Лаборатория-тек Nunc 155441 1
QDot-605 стрептавидин Invitrogen Q10101MP 20 мМ
Биотинилированные Fab (для синтеза Fab, см. ссылку 21)
Fab от МКА 108 ATCC HB-9764 200 мкг
NHS-биотин Thermo Scientific 21435 18,5 мкг
Заполните средних
DMEM GIBCO 41965 500 мл
Эмбриональной телячьей сыворотки SIGMA F7524 50 мл
L-Глютамин GIBCO 25030 5 мл
HEPES GIBCO 15630 5 мл
Пируват натрия GIBCO 11360 5 мл
Изображений среднего
HBSS с Са 2 + GIBCO 14025 25 мл
HEPES GIBCO 15630 250 мкл

1 "> Оборудование Компания Ссылка Инвертационный микроскоп Nikon Затмение TE2000U Флуоресцентная лампа Nikon Intensilight C-HGFIE 1,3 Н.А. 100x цель Nikon Plan Fluor 1,30 1,49 NA 100x цель Nikon APO TIRF 1,49 Камера Ропер Научная Каскад 512 Б Термостатируемое окне Жизнь изображений услуги Box

Приложение: пример сценария МТТ дополнительном анализе

Функция MTT_example (file_name)
%%% Основные примеры, показывающие, как восстановить МТТ вывода результатов
%%% Построить каждый тракэлектронной и построить гистограмму
%%% По интенсивности флуоресценции

если Наргин <1% file_name не предоставляется?
Файлы = каталог ('* STK.');
если IsEmpty (файлы), DISP («нет данных в текущей директории), возвращение, на конец
. file_name = файлы (1) имя,% по умолчанию: первый файл STK
DISP (['использование' file_name 'по умолчанию'])
конец

file_param = [имя_файла '_tab_param.dat'];% выходной файл

Данных%% нагрузки
компакт-диск («output23 ')% и (' output22), в зависимости от используемой версии
% Предупреждение: версия 2.2 генерирует только 7 параметров,
% Дополнительный параметр, шум, была добавлена ​​в версии 2.3

% Чтобы прочитать всем параметрам сразу, в одной таблице
% = Tab_param fread_all_param (file_param);
% Таb_i = tab_param (2:8: в конце :); tab_j = ...

% Чтобы прочитать все параметры (кроме frame_number) в отдельные таблицы
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);

tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);% индекса 3, так как количество следов и номер кадра, не информативны, удаляются!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);

%% Цикл по следы
N_traces = размер (tab_i, 1);
% Таблицы N_traces линий N_frames колонн

для itrc = 1: N_traces
No_blk_index = tab_blk (itrc, :)> 0,%, не мигают шаги только
участка (tab_i (itrc, No_blk_index), tab_j (itrc, No_blk_index))
NB &П., xlabel ('я (пикселей)), ylabel (' J (пиксель))
название ([num2str "след # '(itrc)])
DISP ('Пожалуйста, ударить любую клавишу на следующий след "), пауза
конец

%% Fluo гистограмма
N_datapoints = сумма (tab_blk (:)> 0);% не мигает шаги только
история (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * SQRT (N_datapoints))% с помощью 2sqrt (N) бункеров
xlabel («интенсивность (АС)), ylabel (« случай »)
название («Гистограмма частиц интенсивность флуоресценции)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiple Target TracingSingle Particle TrackingEpidermal Growth Factor ReceptorQuantum Dot LabelingHigh Density ImagingTrajectory ReconstructionPeak DetectionDeflation AlgorithmTransient Confinement AnalysisMonte Carlo Simulations

Related Articles