Отображение молекулярной диффузии в плазме мембраны Несколько-Target трассировки (MTT)

Summary

Несколько-Target Трассировка домашнее алгоритм, разработанный для отслеживания индивидуально меченых молекул в мембране живой клетки. Эффективное обнаружение, оценку и отслеживание молекул с течением времени при высокой плотности обеспечивает удобный, комплексный инструмент для исследования наноразмерных динамика мембраны.

Abstract

Нашей целью является получить подробное описание молекулярных процессов, происходящих в клеточных мембранах в различных биологических функций. Мы стремимся характеризующие сложную организацию и динамику плазматической мембраны в одной молекуле уровне, путем разработки аналитических средств, предназначенных для Одночастичные Tracking (SPT) при высокой плотности: Несколько-Target Tracing (МТТ) ^1. Одиночных молекул видеомикроскопии, предлагая миллисекунды и разрешение нанометрового ^1-11, позволяет детальное представление мембраны организации ^12-14, точно отображение дескрипторов, таких как клеточные рецепторы локализация, подвижность, родов или взаимодействий.

Мы вновь SPT, как экспериментально, так и алгоритмически. Экспериментальные аспекты включены оптимизации установки и мечения клеток, с особым акцентом на достижение максимально возможной плотности маркировки, с тем чтобы обеспечить динамический снимок молекулярной динамикии все происходит внутри мембраны. Алгоритмические вопросы, касающиеся каждого шага для восстановления траектории: пики обнаружения, оценки и воссоединения, рассмотрены конкретные инструменты анализа изображений ^15,16. Реализация дефляции после обнаружения позволяет спасать пики изначально скрыты от соседних, более сильные пики. Следует отметить, что улучшение обнаружения непосредственно влияет на повторное, на сокращение разрыва в траектории. Выступления были оценены с использованием метода Монте-Карло для маркировки различной плотности и шум значения, которые обычно представляют собой два основных ограничения на параллельных измерений при высокой пространственно-временной разрешение.

Нанометрового точность ¹⁷ получены отдельные молекулы, используя либо последовательного включения / выключения photoswitching и нелинейной оптике, могут обеспечить исчерпывающую наблюдений. Это является основой наноскопия ¹⁷ таких методов, как STORM ¹⁸ PALM ^{19,20, 21} или RESOLFT Стед ^22,23, бееч. часто требуют фиксированных изображений образцов. Главной задачей является выявление и оценка дифракционного пика, исходящих из одной молекулы. Таким образом, обеспечение надлежащего предположения, такие как обработка постоянная точность позиционирования, а броуновское движение, МТТ прямо подходит для наноскопических анализа. Кроме того, МТТ может принципиально быть использован на любом уровне: не только для молекул, но и для клеток или животных, например. Таким образом, МТТ является мощным алгоритм слежения, что находит применение в молекулярной и клеточной масштабах.

Protocol

В этом видео мы представляем полный одном эксперименте отслеживания частиц, с помощью квантовых точек, ориентированных на конкретные рецепторы мембраны. Основная цель этого эксперимента заключается в дискриминационной различных типов молекулярных поведения диффузии измеряли в плазме мембраны живых клеток. Более того, молекулярные движения, возникающие на мембране как правило, может отличаться от броуновской диффузии, будучи линейно направленный или заключены в нанодоменов ^26-29, например. Мы стремимся одновременно как после многих рецепторов, технически это возможно, дают представление о многообразии возникающих в динамике происходящих в мембране живой клетки. Это в конечном счете, как ожидается, позволит расшифровке механизмов регуляции клеточной сигнализации поверхностных рецепторов.

1. Культуре клеток

1. Подготовка сотовой пример: использование сторонник COS-7 клетках, которые эндогенно выражают рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) ^30. Когдаработа с живыми клетками без антибиотиков убедитесь, что не скрытая под обнаружению загрязнений с помощью соответствующих методов стерильной в течение всего времени приготовления.
2. Рост клеток в полной среде (DMEM с 10% телячьей сыворотки, 1% глутамина, 1% HEPES и 1% пируват натрия, см. таблицу специфических реагентов ниже), при 37 ° C с 7% CO _2, заботясь, чтобы иметь их в суб-вырожденная, экспоненциальный рост до распространения их в Lab-Tek.
3. За день до эксперимента, распространился 5000 клеток / лунку в 8-и камер (Lab-Tek) и инкубировать в течение ночи. Подсчет клеток обеспечивает постоянную плотность клеток, следовательно, воспроизводимые отношения квантовых точек на камеру.

2. Сотовые маркировки

Подготовить квантовых точек с определенным покрытием. Квантовой точки являются люминесцентные наночастицы, состоящие из полупроводников. Эти наночастицы представляют большой интерес, потому что они очень яркие и photostable по сравнению с классическимифлуоресцентных зондов ^31,32, что позволяет достижение соответствующего сигнала к шуму (SNR) для одного изображения молекулы.

1. Перед проведением эксперимента, производят Fab фрагментов против EGFR из гибридомной клеточной линии (МКА 108, ATCC HB-9764), при переваривании папаин, как описано выше ^21.
2. Сопряженное Fab с биотином, в соответствии с инструкциями изготовителя (EZ-ссылка сульфо-NHS-LC-биотинилирование Kit; Thermo Scientific, рис 1а.).
3. Использование квантовых точек с функциональными стрептавидина (Invitrogen) и излучающие на 605 нм (оптимальная длина волны излучения для блеска, обнаружения и отделения от сотовой флуоресценции).
4. Подготовка маркировки решение в полной среде (см. таблицу конкретных реагентов) для того, чтобы насытить streptavidins настоящее время около квантовых точек, а также для предотвращения агрегации и неспецифического связывания с клетками и покровного стекла.
5. Приготовьте два промежуточных решений:один с квантовыми точками, стрептавидином, а другой с биотинилированного Fab, каждый на 20 нм.
6. Смешайте равные объемы этих двух решений: смешать квантовых точек с Fab в соотношении 1:1 для получения окончательного рабочего концентрации 10 нМ Fab: квантово-точек комплекса. Использование эквимолярном соотношении способствует образованию моно-функциональными комплексами состоит из одной квантовой точки и одна биотинилированного фрагмент Fab. Это способствует моновалентной маркировки, ограничивая артефактом наблюдений в связи с рецептором сшивания ^33,34.
7. Инкубировать 15 минут при 25 ° C, используя шейкер в 1200 оборотов в минуту для предотвращения агрегации. Смесь тогда готова к использованию на живые клетки.
8. Инкубируйте клеток в 100 мкл смеси в течение 5 минут при 37 ° C с 7% CO _2.
9. Промойте клетки с неправительственными организациями, autofluorescent изображений среды (HBSS буфера, 1% HEPES, см. таблицу специфических реагентов) предварительно нагревают при 37 ° C.
10. Аккуратно удалите излишки этикеток для предотвращения ООНнеобходимости портить SNR по несвязанным, в фокусе квантовых точек, по широко стиральная каждую лунку с изображениями среднего, как правило, в 5 раз при комнатной температуре, по крайней мере 5 минут задержки до последнего ополаскивания.

3. Оптическая установка

Видео-микроскопия установка состоит из четырех основных частей:

1. Инвертированный микроскоп с определенной флуоресценции куба (FF01-457/50 возбуждения, FF495-Di02 дихроичных и FF01-617/73 фильтры излучения, Semrock) и высокой числовой апертурой (1.3 или 1.49) нефти погружения 100x цели.
2. 100 Вт ртутной лампы (в сочетании с микроскопом через оптическое волокно, избегая вмешательства в терморегуляции).
3. 512 х 512 пикселей Высокая чувствительность камеры EMCCD для достижения достаточной SNR.
4. Инкубатор держать биологических образцов при температуре 37 ° С в течение эксперимента.

4. Приобретение

1. Выберите изолированных и хорошо распространение клеток. Этоспособствует расширению красиво, плоский lamellipodia, лучше всего приспособлены для поиска плоского движения мембраны молекул.
2. Оцените сотовой физиологического состояния его появление как в проходящем свете и флуоресценции: интенсивный трафик везикулярное, отсутствие некротических или апоптотических признаков, низкий флуоресценции, а средний-сильный квантовых точек маркировки (как правило, до 1000 квантовых точек в ячейке см. Рис. 1B, C).
3. Выберите высокой плотности маркировки, которая имеет решающее значение для одновременного мониторинга, как много рецепторов, насколько возможно. Это на самом деле ограничивается как физиологические (поверхностное выражение, эпитоп доступности, боковое движение) и алгоритмических параметров (неперекрывающихся точки распространения функций (НПФ), даже с учетом размытия в связи с движением, для обеспечения надлежащего выявления и повторного).
4. Для каждой ячейки, сначала получить изображение светлого поля (предпочтительно использование ДВС, если таковые имеются), которые могут в дальнейшем позволит проверки клетки аспекти пространственные пределы lamellipodia.
5. Сохраните это изображение с тем же именем, как видео-стека (например, cell1.tif и cell1.stk например), в суб-папку DIC, так как с этими конвенциями, алгоритм может автоматически находить назад соответствующий образ для каждый стек.
6. Получить от 1 до 3 видео в камере, постоянно, как правило, на 36 мс Скорость, достижимая быстрыми темпами в полном кадре с помощью этой камеры. Однако можно приобрести на более высоких частотах, вплоть до 1 мс Скорость, с помощью специальных ПЗС-матрица с повышенной чувствительностью и / или менее пикселей. Кадр передачи технологий обеспечивает незначительной задержкой между кадрами.
7. Электронная многократно повышение всегда должно быть установлено на максимум (чуть ниже насыщения, если необходимо), чтобы достижение одной молекулы чувствительности, с достаточным SNR, по крайней мере выше 20 дБ (пик для эффективного обнаружения ^1), как правило, около 25-30 дБ.
8. Обычно приобретение 300 кадров в видео, грехсе траектории реконструировано более ~ 100 кадров в среднем, в основном ограничиваются долго мигает событий. Частота видео и длина могут быть адаптированы для данной меры, которые могут потребовать больше следов, например.

5. МТТ анализ

1. Выберите путь к каталогу, содержащему видео-файлы для оценки данного набора данных с Matlab или октавы.
2. Для начала полностью автоматизирован анализ ^1,35, введите команду detect_reconnex23 в октаву, или MTT23i в Matlab. Эта программа выступает за "версии 2.3, с пользовательским интерфейсом" и доступен для скачивания вместе с предыдущей версией 2.2. Сначала он отображает графический интерфейс перечислены все параметры, используемые, как показано на рис. 2.

6. Представитель Результаты

МТТ автоматически анализирует каждый видеомагнитофон, чтобы доставить следы обнаружены и оценка целей, дополняется в дальнейшемваний, таких, как лишение свободы обнаружения. В конечном итоге это позволяет отображение следов на ячейки изображения (рис. 1С и 3).

МТТ Описание

Анализ основных МТТ ведется по каждому кадру, ссылаясь на 3 основных задач (рис. 3):

1. Обнаружение наличия или отсутствия цели (квантовых точек), в скользящей субрегиона последовательно вокруг каждого пиксела, где две гипотезы сравниваются: наличие любого из сигналов, с PSF modelized как двумерного гауссовского пика , или только шума, используя порог страхования достаточно низкой ложной тревоги, с менее чем одной ложные обнаружения в кадре. Это приводит к карте вероятность обнаружения. Каждый локальный максимум считается предполагаемым цели, гарантируя, что его вероятность на уровне выше минимального значения, устанавливается в соответствии с желаемой вероятность ложной тревоги (PFA). Этот предел установлен достаточно низко, чтобы эффективно различать сигналсигналы от шума, не допуская в лучшем случае ложных обнаружений (PFA 10 ^-6 по умолчанию, чтобы обеспечить менее одной ошибки в 512 х 512 пикселей изображения), в то же время позволяет достаточно высокой вероятности обнаружения, достигая оптимального теоретически предсказан ^1. Отметим, что требование об использовании суб-региона следует, что образ границы (3 пикселей, по умолчанию окна 7 х 7 пикселей) не может быть оценена.
2. Оценка для каждой обнаруженной цели, соответствующие параметрам, таким как суб-пикселей положение и интенсивность сигнала. Для каждой обнаруженной цели, наименьших квадратов Гаусса-Ньютона подгонка следующий осуществляется оценить положение, ширина и высота обнаружены Гаусса. Это обеспечивает особенно субпиксельной положение краситель (от 10 до 20 нм, точность типичные значения SNR и неподвижными или медленно диффундирующих красителей, увеличивается до ~ 100 нм для красителей распространении на 0,1 мкм ² / с).
3. Повторное подключение новых задач сСледы уже построено за предыдущие кадры. Набор новых задач сочетается с множеством предыдущих следов. Для этого, для того, чтобы присвоить каждой цели в след, если это возможно, все имеющиеся статистические сведения, полученные от обнаружения шаг используется не только положение, но и интенсивность, ширина мигать и связанные с ними статистики. Таким образом, цели не только назначен в ближайшее следа: в случае пересечения следов, интенсивность, скорость, ширина и мигать будут рассматриваться. Это обеспечивает статистически оптимального повторного счета. Эта стратегия позволяет избежать, по возможности, смещение переподключение к ближайшим соседям.

Обнаружены пики может быть отказано, если апостериорная их оценки или переподключения не удается. Специальный тест обрабатывает обнаружение новых вершин, которая будет инициировать новые следы. Этот тест использует более жесткие PFA (10 ^-7), с повторным пик след может быть интерпретирован как де-факто о проверке е своей актуальности (этот критерий будучи по определению не распространяется на новые вершины).

Анализ траектории

Возможны переходные удержания следующий оценивается функция обратной зависимости от местных диффузии ^24-29. Применение порога позволяет определить ограничивается или нет эпизодов. Повторяя эти за все следы, мы можем отобразить мембраны динамика, в условиях переходного заключения / замедлить события. Это может быть альтернативно представлен либо с помощью двоичного или дискретные значения этого индекса заключения.

По умолчанию, МТТ автоматически выполняет эти задачи, экономя 8 пик параметры в текстовом файле: номер кадра, я и у позиции, интенсивность сигнала, радиус, смещение и мигать, для каждого кадра (группа из 7 строк) и микроэлементов (колонки) . Эти выходные параметры могут быть перегружены в Matlab или Октава использованием fread_data_spt сценарий для дальнейшего анализа, т.е. следов или интенсивность сигнала, как это видно на примере "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example скрипт в приложении.

Дальнейший анализ приводит к карте следы на каждой ячейки (рис. 1С и 3) и обеспечить гистограммы распределения соответствующих параметров (таких, как пик интенсивности, SNR или местного значения диффузии). Для каждого файла, среднее и стандартное отклонение каждого параметра сохраняются в текстовом файле вместе с изображением гистограммы. Логарифмические распределения, например, для смещений R ^2, приводят к средним геометрическим. Коэффициент диффузии вычисляется линейная аппроксимация за первые пять точек MSD кривой. Эти значения обеспечивают обзор эксперимент с участием, например, кинетика клеточных реакций или фармацевтическое / ферментативную лечения, влияющие мембраны организации. С МТТ является открытым исходным кодом, этот аспект может быть легко адаптирована к любой выделенной расследование.

599fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Мониторинг динамики мембранных рецепторов с помощью МТТ. (А), мембранные компоненты, такие как EGFR, помеченные квантовыми точками связаны с биотинилированного фрагменты Fab (схематическое изображение с правильной примерно масштабирование каждой молекулы). (B) Типичная флуоресцентное изображение приобрело от живого COS-7 клетки, с 36-мс время экспозиции, изображающие дифракционной пиков, соответствующих индивидуально помечены рецепторов. (C) Выход МТТ анализ отображает восстановленные траектории рецепторов, накладывается на светлое изображение клетки.

Рисунок 2. МТТ входных параметров. Запуск MTT23i открывает графический интерфейс пользователя список всех входных параметров, имена и значения по умолчанию, как описано в нашей предыдущей публикации ^1. В алгоритме, пространства и времени параметры (поиск окна, пик радиус, максимальная диффузия и мигающий) в безразмерных условных единицах, пикселей и кадры. Калибровка может быть применен для преобразования апостериорных вывода результатов. Значения по умолчанию, что соответствует Каскад 512BFT с 100х увеличением, имеют размер пикселя: 156 нм / пксл и рама задержки: 36 мс / кадр.

Следователи должны оптимизировать несколько важных параметров, таких, как ожидается максимальный коэффициент диффузии ("Разница Макс") и максимальной мигает исчезновения ("T _с"). Эти два места и сроки, практически единственные, которые должны быть пересмотрены для данного экспериментальных условиях, другие создаются для надежного значения по умолчанию. Например, число ложных срабатываний напрямую установить для обеспечения менее чем за одну ошибку на миллион пикселей, следовательно, менее одного кадра, который является удовлетворительным для большинства случаев. Все параметры сохраняются в текстовый файл в папку вывода, что позволяет пользователям проверить после настройки, которые были использованы для анализа.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "ALT =" 3 "/>
Рисунок 3. Основные этапы анализа МТТ. Начиная с экспериментальными стек флуоресцентных изображений, пики последовательно и автоматически, по оценкам подходит гауссовой и подключение на кадрах (первый круг операций, верхняя часть блок-схемы). Следы могут быть дополнительно проанализированы на предполагаемых родов, например, в конечном счете приводит к динамической карты соответствующих дескрипторов (второй круг операций, нижняя часть).

Рисунок 4. Маркировка валентность не влияет на МТТ. Для оценки возможного смещения введен артефактного поливалентных маркировки, МТТ анализ был проведен для отслеживания эндогенных EGFR помеченный с помощью 2 различные схемы, создавать и анализировать карты траекторий. (A) рецепторы были помечены биотинилированного Fab и квантово-dots605-стрептавидин, как описано в протоколе.В этом случае несколько валентность квантовых точек и streptavidins может привести к связи несколько рецепторов к одному красителя. (B) рецепторы были помечены Fab непосредственно связан с органическим красителем, Atto647N. В этом случае, один Fab, следовательно, одного рецептора, может быть связана с более чем одной краской. (C) Средний квадрат смещения (MSD) кривая вычислена для всех следов для каждой ячейки, обозначенные как с квантовыми точками или Атто красителей (левый и правый графики, соответственно). Коэффициенты диффузии были вычислены линейные подходит на первых пяти точках MSD (красная пунктирная линия). Каждая схема маркировки привели к аналогичным значениям диффузии (центральный график). Qdot: квантово-dots605 (п = 5 клеток), Атто: Atto647N (п = 7 клеток), нс: не имеет значения (Т-критерий Стьюдента значение р> 0,05).

Discussion

В одночастичной слежения, рядом с клеткой и микроскопии аспекты, анализ представляет собой значительную часть работы. Это решает алгоритм, используемый для выполнения трех основных задач: выявление, оценка и снова пики над каждым кадром. Но последующее аспектом этой работы заключается в разработке алгоритма себя, что, возможно, придется адаптироваться к любой новой выделенной расследования, в основном для последнего, дополнительные меры (например, расшифровка режимов движения, взаимодействия или стехиометрии).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Компания	Номер по каталогу	Количество
Потому-7 клеточной линии	ATCC	CRL-1651	5000 клеток / лунку
HBSS без Са 2 +	GIBCO	14175	1 мл
0,05% Трипсин EDTA	GIBCO	25300	1 мл
8-а Лаборатория-тек	Nunc	155441	1
QDot-605 стрептавидин	Invitrogen	Q10101MP	20 мМ
Биотинилированные Fab (для синтеза Fab, см. ссылку 21)
Fab от МКА 108	ATCC	HB-9764	200 мкг
NHS-биотин	Thermo Scientific	21435	18,5 мкг
Заполните средних
DMEM	GIBCO	41965	500 мл
Эмбриональной телячьей сыворотки	SIGMA	F7524	50 мл
L-Глютамин	GIBCO	25030	5 мл
HEPES	GIBCO	15630	5 мл
Пируват натрия	GIBCO	11360	5 мл
Изображений среднего
HBSS с Са 2 +	GIBCO	14025	25 мл
HEPES	GIBCO	15630	250 мкл