Искусственный клеток являются недостаточными модель повторять иннервируемых мышц В естественных условиях. Функциональный блок двигателя может быть воспроизведена В пробирке По иннервации дифференцированных человеческих первичных клеток эмбриона крысы использование эксплантов спинного мозга. Эта статья описывает, как со-культур спинного мозга и эксплантов мышечных клетках установлены.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Функциональный блок двигателя в культуре блюдо: Co-культуре эксплантов спинного мозга и мышечных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человека первичных клеток культивировали в монослое aneurally редко контракт спонтанно, потому что, при отсутствии нервного компонента клеточной дифференцировки ограничены и двигательных нейронов возбуждение отсутствует 1. Эти ограничения препятствуют в пробирке исследования многих нервно-мышечных заболеваний в культуре клеток. Важно отметить, что экспериментальные ограничения monolayered, культивируемых клетках мышц может быть преодолен функциональный иннервации мышечных волокон с спинного мозга в эксплантов со-культур.
Здесь мы покажем, различные шаги, необходимые для достижения эффективных, надлежащих иннервации человека первичных клеток, приводит к полной дифференциации и сокращения волокна в соответствии с методом, разработанным Askanas 2. Для этого, мышечные клетки культивировали совместно со спинальной эксплантов шнур эмбрионов крыс на ED 13.5, со спинной ганглий корень все еще прикреплены к спинной кусочки мозга. Через несколько дней, мышцы FiБерс начать сокращаться и в конечном итоге стать поперечно-полосатой через иннервации функциональной невриты, выступающую из спинного мозга, что эксплантаты подключения к мышечным клеткам. Эта структура может сохраняться в течение многих месяцев, просто регулярный обмен питательной среде.
Применение этого бесценного инструмента являются многочисленными, как он представляет собой функциональную модель междисциплинарного анализа человеческого развития мышц и иннервации. На самом деле, полное заново нервно-мышечного соединения установка происходит в культуре блюдо, позволяющий легко определить многие параметры на каждом шагу, в фундаментальные и физиологические контексте.
Просто приведу несколько примеров, геномных и / или протеомных исследований могут быть выполнены непосредственно на со-культур. Кроме того, в пред-и пост-синаптические эффекты могут быть специально и отдельно оценивается в нервно-мышечном соединении, так как компоненты из разных видов,крысы и человека, соответственно. Нервно-мышечного со-культуры могут быть выполнены с человеческими клетками, выделенных от больных страдают от мышечной или нервно-мышечными заболеваниями 3, и таким образом может быть использован в качестве инструмента отбора кандидатов для лекарств. Наконец, ни специального оборудования, но регулярно BSL2 объект, необходимых для воспроизведения функциональных двигательных единиц в культуре блюдо. Этот метод так ценен как для мышц, а также нервно-мышечных общин исследования физиологических и механических исследований нервно-мышечных функций, в нормальные и заболевание контексте.
Протокол
1. Подготовка первичной человеческой культуры мышечных клеток
- Установить культуре человеческих клеток мышц в соответствии с эксплантации-ре-эксплантации техника 4. Во-первых, удалите не-мышечной ткани биопсии. Затем вставлять 1 мм 3 эксплантатах мышцы в сгусток плазмы, что позволяет фибробластов, чтобы выйти из эксплантов.
- Встроенный эксплантов переносятся на плазменных желатин покрытием блюдо, и пусть они растут в нормальных среднего роста (MEM дополнена с 25% средних 199, 10% эмбриональной телячьей сыворотки [FBS], 1% пенициллина / стрептомицина, 10 мкг / мл инсулина, 10 нг / мл человеческого эпидермального фактора роста [EGF], 12,5 нг / мл, человеческий фактор роста фибробластов [FGF]) в монослое. Клетки, которые возникают из эксплантов в этих условиях являются мышечные клетки. Эти клетки будут продолжать расти в монослоя после удаления эксплантов.
- Культура клеток aneurally на 0,1% желатина покрытие пластин в нормальном среднего роста. Клетки могут бытьaneurally культивировали и усиливается по мере необходимости. Лучше использовать мышечные клетки в проход между 3 и 8 для выполнения совместного культур. Очень важно, чтобы молодые иннервируют myotubes, после этой точки, со-культуры имеют высокий риск неудачи. Кроме того, myotubes не должны быть слишком большими и слишком толстая.
- За два дня до иннервации Планируется, плиты мышечных клеток на 35 мм культуры тканей блюд (или 6 и плит) при плотности 500000 клеток на чашку в нормальном среднего роста. При этом плотность клеток на должном слияния, чтобы начать сплав на следующий день, и последующие иннервации на следующий день после этого. Используя эти условия, myotubes в правильном этап для оптимального иннервации и, следовательно, последующего сокращения волокна.
- На следующий день, заменить нормального среднего роста слияние среды, состоящей из MEM дополнена с 25% среды 199, 5% FBS, 10 мкг / мл инсулина и 1% пенициллина / стрептомицина.
2. Isolati на из крысы эмбриональных спинного Экспланты шнура
Вся процедура для изоляции эксплантов спинного шнур проводится под бинокулярным микроскопом, в сбалансированный солевой Хэнка Решение (HBSS, Gibco / Invitrogen ссылка 14170), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Важно, чтобы крыса эмбрионов между ED 13 и 14 разных стадиях развития может поставить под угрозу весь процесс. Пожертвуйте беременной женщины с CO 2 и собрать всю цепочку эмбриона в HBSS среды. Изолировать каждого эмбриона и обезглавить их за эвтаназию.
- Проанализируйте спинного мозга эмбриона от остальной части тела в одну часть и удалите окружающие мышцы и соединительную ткань. Будьте очень осторожны, чтобы сохранить спинной узлы корня (ДРГ), подключенных к спинному мозгу для обеспечения функциональной иннервации.
- Разрежьте каждый спинной мозг поперек таким образом, что каждый эксплантов содержит не менее 2 DRG прилагается к нему (эксплантов в 1 мм 3).
- Удалить слияние среды на культуре мышечных клеток, оставляя тонкий слой среды на монослой.
- Поместите эксплантов внимательно на слой мышечных клеток, пять равномерно распределенных эксплантов на 35 мм блюдо.
- Добавить очень медленно, падение мудрый, слияние среды на каждом эксплантов. Стоит добавить средство для мышечных клеток, чтобы выжить, но не слишком много, чтобы позволить эксплантов соблюдать первую и вступить в контакт с клетками. Если среда не добавляется неправильно (слишком сильно или слишком много средних), эксплантаты будет плавать и не сможет иннервирующих мышечные клетки.
- После эксплантов начинают придерживаться, начало слияния среднего до 2 мл на 35 мм блюдо и поставить блюда очень тщательно обратно в инкубатор.
4. Обеспечение Гетерологичная нервно-мышечной сотрудничества культур
- Изменение средних слияние два раза в неделю.
Как только через два дня после иннервации, то можно увидеть, невриты выходящих из каждого эксплантов и установление контактов с мышечными клетками, представленные на кнопку структуры (рис. 1).
Уже через 4-6 дней после иннервации, несколько отдельных волокон начнет сокращаться.
Сокращения сохраняться в течение многих месяцев, поддерживается только за счет изменения культуральной среде в два раза в неделю.
Примерно через 2 недели, спинной эксплантов шнур, вырождается, но иннервации сохраняется. Это нормально. Тонкий слой нервных компонент остается на поверхности слоя мышечных клеток. Эта нервная сеть, достаточное для поддержания функциональных возможностей мотора.
Если эксплантаты плавать в среду на следующий день после иннервации, они никогда не будут придерживаться. Это происходит, когда мышечный слой клеткиНе достаточно сливной или когда среда добавили слишком грубо. Иногда эксплантов придерживается, но не невриты появятся. Вероятно, это связано с отсутствием DRG прилагается к нему. В этом случае также, иннервации не будет создана. Манипулирование блюда очень тщательно первую неделю, как эксплантов можете отделить легко. Для обмена Fusion Media, добавьте жидкость по каплям с минимальной скоростью, чтобы избежать клетки отряда.
Рисунок 1. Спинной мозг эксплантов-мышечных клеток со-культур от 1 дня до 15-й день.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Физиологические в пробирке инструментом для изучения функции мышечных клеток в норме и патологии контексте наибольший интерес для myologists, потому что культуру мышечных клеток, как правило, не повторять о важности нескольких ячеек и типа соединения. Кроме очищенной моторных нейронов с мышечными клетками, недостаточно для достижения функционального блока двигателя, так как наличие клеток Шванн требуется для иннервации, чтобы быть эффективными 5 и не топологически (3D + специальное распределение) соо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Наша работа при поддержке Швейцарского национального научного фонда (ОЯТ), швейцарская инициатива в системной биологии (SystemsX.ch), мышечная дистрофия ассоциации США (MDA), Ассоциация Française контр-ле-Миопатии (АСМ), Соединенные митохондриальной болезни фонда (UMDF), Геберт-ОРФ Фонд редких болезней программы (ГРФ), Швейцарского общества исследований мышечных заболеваний (SSEM / FSRMM), Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit унд медицинских исследований", Roche Фонд исследований и университета Базель.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
| HBSS | Гибко / Invitrogen | 14170 | |
| MEM | Гибко / Invitrogen | 31095 | |
| Среды 199 | Гибко / Invitrogen | 31153 | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки | Плод клонов Perbio | SH30066.03 | |
| Инсулина | Сигма | I9278 | |
| ЭФР человека | Сигма | E9644 | |
| Человека FGF | СиGMA | F0291 | |
| Пенициллина / стрептомицина решение | Гибко | 15140 |
Ссылки
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
