Роман флуоресценции На месте Гибридизации (FISH), который одновременно рассматривается как численные и структурные изменения хромосом, в частности, специфической хромосомной транслокации связанных с лейкемией и лимфомой, из всех 24 хромосом человека на одном устройстве в одной гибридизации, описан.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Chromosomics: Определение численного и структурные изменения во всех 24 хромосом человека одновременно, используя Роман OctoChrome Анализ FISH
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) — это метод, позволяющий обнаруживать специфические последовательности ДНК в метафазных или интерфазных хромосомах в ядрах клеток1. В данном методе используются ДНК-зонды с уникальными последовательностями, которые гибридизуются с целыми хромосомами или определенными хромосомными участками, что делает его мощным дополнением к классическому цитогенетическому анализу. Например, во многих ранних исследованиях с использованием классического цитогенетического анализа сообщалось о частом выявлении повышенного уровня хромосомных aberраций у пациентов с лейкозом, связанных с воздействием бензола, у пациентов с отравлением бензолом, а также у здоровых работников, подвергавшихся воздействию бензола2. С помощью метода FISH было установлено, что уровень лейкоз-специфических хромосомных перестроек повышен и у внешне здоровых работников, подвергавшихся воздействию бензола3-6, что указывает на критическую роль цитогенетических изменений в индуцированном бензолом лейкопоэзе.
Как правило, один анализ FISH позволяет исследовать только одну или несколько целых хромосом или специфических локусов на одном предметном стекле, поэтому для охвата всех хромосом человека требуется проведение множественных гибридизаций на нескольких стеклах. Спектральный кариотипинг (SKY) позволяет одновременно визуализировать весь геном, однако необходимость в специальном программном обеспечении и оборудовании ограничивает его применение7. Здесь мы описываем новый метод FISH-анализа, OctoChrome-FISH, который может быть применен для Chromosomics — термина, под которым мы здесь подразумеваем одновременный анализ всех 24 хромосом человека на одном предметном стекле в исследованиях человека, таких как общехромосомный анализ анеуплоидии (CWAS)8. В основе метода, который компания Cytocell реализует под названием Chromoprobe Multiprobe System, лежит устройство OctoChrome, разделенное на 8 квадратов, каждый из которых содержит три различных зонда для окрашивания целых хромосом (Рисунок 1). Каждый из трех зондов напрямую мечен флуорофором другого цвета: зеленым (FITC), красным (Texas Red) и синим (Coumarin). Расположение комбинаций хромосом на устройстве OctoChrome было разработано таким образом, чтобы облегчить идентификацию неслучайных структурных перестроек хромосом (транслокаций), встречающихся при наиболее распространенных лейкозах и лимфомах, например t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Кроме того, одновременно могут быть обнаружены численные изменения (анеуплоидия) хромосом. Соответствующее шаблонное стекло также разделено на 8 квадратов, на которые закреплены метафазные пластинки (Рисунок 2), и помещается поверх устройства OctoChrome. Зонды и целевая ДНК денатурируют при высокой температуре и гибридизуются в увлажненной камере, после чего все 24 хромосомы человека могут быть визуализированы одновременно.
OctoChrome FISH представляет собой перспективный метод клинической диагностики лейкозов и лимфом, а также выявления анеуплоидий во всех хромосомах. Мы применили этот новый хромосомный подход в исследовании CWAS среди китайских рабочих, подвергавшихся воздействию бензола8,10.
Протокол
1. Подготовка образцов слайдов
- OctoChrome FISH предназначен для изучения изменений хромосом в метафазе распространяется клеток человека, в том числе, но не ограничиваясь культурно клеток периферической крови, стволовых / прогениторных клеток и клеточных линиях. Образцы должны быть подготовлены следующие стандартные процедуры для уборки метафаз 3,11-13: за счет использования колцемид лечения арест клеток в метафазе, гипотонической обработки клеток набухать, и Карнуа фиксатор, чтобы исправить клеток в суспензии примерно в 0,5-1 х 10 6 клеток на мл.
- Очистите 8 квадратных слайде (при условии, в OctoChrome Kit, Catalogue #: PMP 803, Cytocell Ltd, Кембридж, Великобритания, 2) путем погружения в чистом этаноле в течение 2 мин.
- Перед образца слайдов, поместите небольшое количество клеток на слайд, чтобы проверить плотность клеток. Если плотность клеток слишком высок (слишком много перекрывающихся ячеек), разбавленные суспензии свежей фиксатором. Если плотность клеток является слишком низкой (слишком мало клеткис на слайде), спином вниз клетки и вновь приостановить меньший объем свежего фиксатора. Внесите 5-10 мкл клеточной суспензии на каждом из 8 районов шаблон слайда в последовательности чередующихся квадратов 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. После первых двух квадратов имеет воздушно-сухой, определить оставшиеся площади в том же порядке. Это позволит предотвратить клетке передается от мешая друг другу.
- Высушенные слайд можно хранить при температуре -20 ° С в атмосфере азота в течение более 5 лет, прежде чем гибридизации.
2. Локализация метафаз использованием автоматизированной системы
- Применение 20 мкл 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (0,2 мкг / мл) в центре каждой половине слайда, а затем накрыть покровным стеклом.
- Выполнять автоматизированное сканирование образцов слайдов локализовать метафазных клеток с использованием программного обеспечения Metafer (метасистемы, Altlussheim, Германия). Это облегчает расположение всех метафаз и будущие переоценки всех клеточных изображений.
- Просмотр результатов сканирования вручную и удалять без метафазы артефактов.
3. Гибридизация
- Подготовка слайд образца и устройство OctoChrome
- Опустите образец слайда в буфер 2x SSC при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы смыть DAPI.
- Высушить образца слайдов с помощью ряда этанола мойки (2 минуты в 70%, 85% и 100% этилового спирта), дать высохнуть и поместить на 37 ° С плиты на 5 минут.
- Поместите гибридизации Chromoprobe Multiprobe палаты (при условии, в OctoChrome Kit) при 37 ° С на водяной бане и дать, чтобы уравновесить до 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- Смешать гибридизации решение (если в OctoChrome Kit) повторными пипетирования и предварительно теплой 25 мкл в OctoChrome устройства до 37 ° C.
- Предварительно каждый теплый OctoChrome устройства (при условии, в OctoChrome Kit, см. рисунок 2) до 37 ° C, поместив стороны устройства этикеткой вверх на плите. Не прикасайтесь тОн тиснением поверхности OctoChrome устройства, поскольку они содержат зондов.
- Позиционирование образца слайдов на OctoChrome устройство (рис. 2)
- Добавить 2 мкл предварительно нагретой гибридизации решение каждой из восьми областей на предварительно нагретой OctoChrome устройство, пока оно остается при 37 ° C.
- Аккуратно перевернуть шаблон скользят по OctoChrome устройства, такие, что число 1, который в настоящее время с ног на голову, находится в верхней правой рукой область устройства OctoChrome. Чтобы найти площадь 1, свою позицию по устройству был отмечен в Orange.
- Убедитесь, что шаблон слайда тщательно согласованы с соответствующими области на OctoChrome устройства. Осторожно опустите скользят по OctoChrome устройство так, чтобы капли гибридизации решение вступить в контакт с горкой. Применить нежный, даже давление для того, чтобы гибридизация решение распространяется на краю каждой из областей подняли на OctoChrome устройства.
- Подниматьслайд / OctoChrome, тщательно проведения замороженный конец стекло, и инвертировать, чтобы слайд под OctoChrome устройства. Убедитесь, что устройство не мазка через шаблон слайда, так как это может привести к перекрестного загрязнения проб.
- Место на 37 ° C (+ / - 1 ° С) плиты на 10 минут.
- Денатурация
- Передача устройства образца слайдов / OctoChrome к плите с особой тщательностью, чтобы держать его уровня. Убедитесь, что образец слайдов равномерно контакты плиту.
- Денатурировать на плите при температуре 75 ° C (+ / - 1 ° C) в течение 5 минут.
- Гибридизация
- Место слайд образца / OctoChrome устройства в гибридизации палаты Multiprobe Chromoprobe.
- Замените крышку и плавать камеры в 37 ° C (+ / - 1 ° C) водяной бане (не - перемешивания) в течение ночи. Пожалуйста, обратите внимание: НЕ уплотнения крышки на камеру гибридизации; НЕ запечатать крышкой на водяной бане, не гибридизуются винкубатора. Эти меры имеют важное значение для контроля влажности.
- После гибридизации мойки
- Приготовление раствора мытья
Решение 1: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 0.4x SSC. Равновесие до 72 ° C (+ / - 1 ° C) на водяной бане и регулирования рН до 7,0.
Решение 2: Подготовка Коплин / Hellendahl сосуд 2x SSC и 0,05% Tween 20. Дать постоять при комнатной температуре. - Удалить OctoChrome устройство тщательно от слайдов и поместить слайд в раствор 1 на 2 минуты.
- Поместите в слайде Решение 2 в течение 30 секунд.
4. Монтаж и визуализации результатов
- Применение 20 мкл DAPI в центре каждой половине слайда и применить покровным.
- Инкубировать в темноте в течение 10 минут при комнатной температуре перед просмотром с помощью флуоресцентной микроскопии.
5. Представитель Результаты
ФигуRe 3A показывает нормальную клетку метафазе на площади 2. (1) - (3): хромосомы 8, 21 и 12 были окрашены в красный цвет, зеленый и синий, и визуализируются через Texas Red, FITC, и DEAC фильтр, соответственно, (4): визуализация с помощью DAPI / FITC / Texas Red тройной фильтр. В целом, хромосомах окрашена синим цветом, не ясно, через тройной фильтр и должны рассматриваться в соответствии с конкретными фильтр DEAC.
Рисунок 3Б показывает, представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидии. (1): т (8, 21), распространенных хромосомных транслокаций в острой миелоидной лейкемией (2): трисомии 21, три копии хромосомы 21, общей анеуплоидии при лейкозах.
Рисунок 1. Расположение хромосом комбинации на OctoChrome устройства и ожидаемые результаты хромосомных живописи.
Рисунок 2. Позиционирования образца слайдов на OctoChrome устройства.
Рисунок 3. Представитель результатыполучены из OctoChrome FISH (площадь 2).
3А. Нормальной клетки с хромосомами 8, 12, 21 окрашены в площади 2.
Рисунок 3B. Представитель аномальных клеток с лейкемией конкретной хромосомной транслокации и анеуплоидия на площади 2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот роман OctoChrome-FISH анализ позволяет одновременно изучить все 24 хромосом человека в одной гибридизации на одном слайде. Расположение хромосом комбинации на 8 квадратов был разработан, чтобы облегчить идентификацию неслучайных хромосомных перестроек в наиболее распространенных лейкозов и лимфом. Таким образом, анализ может обнаружить численного (анеуплоидия), а также структурные (транслокации) хромосом изменения одновременно.
Наиболее важным шагом в этом анализе контролирует влажность...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра М. Cliona Макхейл для критического чтения и редактирования рукописей. Эта работа финансировалась Национальным институтом экологических наук, Национальный институт здравоохранения грант R01ES017452 в L Чжан.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии (опционально) |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd, Кембридж, Великобритания | PMP 803 | |
| фитогемагглютинин (PHA) | Invitrogen корпорации | 10576-015 | |
| Колцемид | Invitrogen корпорации | 15212-012 | |
| Карнуа фиксатором | Метанол: ледяной уксусной кислоты = 3: 1 | ||
| Флуоресценции мильcroscope | Оснащен фильтры для просмотра DAPI, Texas Red, FITC, и кумарин спектра индивидуально и DAPI / FITC / Texas Red тройной фильтр для просмотра различных цветов одновременно | ||
| Metafer программного обеспечения | Метасистемы, Altlussheim, Германия | Содействовать, чтобы найти все метафаз и пересмотреть нарушения |
Ссылки
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
