Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

Краткое содержание

Ткань микрочипов позволяет эффективный метод, чтобы получить одновременно информацию из множества тканей. Представитель части тканей собраны в единый блок парафина. Разделы из блока используется для иммуногистохимии и анализа динамики экспрессии белка. Цифровое сканирование создает соответствующие образы для распространения данных.

Аннотация

Ткани микрочипов (TMA) обеспечивает средства для высокой пропускной способности анализа нескольких тканей и клеток. Техника используется в проекте белков человека Атлас для глобального анализа экспрессии белка моделей в нормальных тканях человека, рак и клеточных линиях. Здесь мы представляем сборку ядра 1 мм, полученных из микроскопических выбраны ткани представителя, в единый блок получателя ТМА. Количество и размер ядер в блоке ТМА может варьироваться от примерно сорок 2 мм ядер сотни 0,6 мм ядер. Преимущество использования ТМА технологии является то, что большое количество данных, можно быстро получить с помощью единого протокола окрашивания, чтобы избежать экспериментальной изменчивости. Важно отметить, что только ограниченное количество дефицитного ткани необходимо, что позволяет при анализе большой когорты пациентов ^{1 2.} Около 250 последовательных секций (4 мкм) могут быть вырезаны из блока ТМА и использованы для иммуногистохимического stainiнг, чтобы определить специфические закономерности экспрессии белка на 250 различных антител. В Человеческий проект белка Атлас, антитела образуются на всех белков человека и использованы для приобретения соответствующего профиля белка в нормальных тканях человека из 144 лиц и рак тканей из 216 разных пациентов, представляющих 20 наиболее распространенных форм рака у человека. Иммуногистохимическое окрашенных ТМА разделы на стеклах сканируются для создания изображений с высоким разрешением, из которых патологи можно интерпретировать и комментировать результаты иммуногистохимии. Изображения вместе с соответствующей патологией на основе данных аннотации сделаны публично доступны для научного сообщества через человеческий белок Атлас портал ( www.proteinatlas.org ) (рис. 1) ^{3 4.} Белки человека Атлас содержит карты, показывающие распределение и относительное содержание белков в организме человека. В настоящее время версияСион содержит более 11 миллионов изображений экспрессии белка данных 12,238 уникальных белков, что соответствует более чем 61% всех белков, кодируемых геномом человека.

Протокол

1. Как подготовить тканей для производства тканей Microarray (анимация 1)

1. Выберите соответствующую фиксированных формалином и парафином материалов (тканей или клеток образцы), включая соответствующие гематоксилин окрашенный срез ткани.
2. Отметить соответствующую область на срез ткани. Рекомендуется иметь свежесрезанных гематоксилин окрашенных раздел соответствующего парафинового блока.
3. Создайте шаблон, используемый для производства АПМ. Случайно образцов внутри шаблона, чтобы избежать артефактов, вызванных техническими проблемами, такими как освещение антител по всему разделу ТМА и секционирования проблем. Добавить дополнительные маркеры ориентация на шаблон для ориентации.
4. Организация тканей в соответствии с шаблоном.

2. Руководство Производство Microarray ткани (необходим для съемок)

1. Для того, чтобы получить стандартизированную длину ткани ядер, отмечают стилет, например, 4,5 мм (рис. 2). GuidelИнес на расстояние между центрами пример:
   ядро размером 0,6 мм - 0,8-1,0 мм
   ядро размером 1,0 мм - 1,8-2,0 мм
   ядро размером 1,5 мм - 2,0-3,0 мм
   ядро размером 2,0 мм - 2,5-4,0 мм
   Рекомендуется оставить 2,5-3,0 мм поля по обе стороны от парафиновых блоков, чтобы избежать растрескивания парафин.
   
2. 1. Установить выбранные удары, которые будут использоваться. Начните с ослаблением шестигранной головкой гнездо, который держит удар на месте. Удар был правильно установлен, когда паз в ступице удар плотно прикладывается к металлическому стержню в пластиковом V-блок. Закрепите винты и убедитесь, что край металлической клипсой горизонтально.
   2. Получатель удар (отмечены зеленым и красным, характерных для дистрибьютора) должны располагаться слева. Донорами удар (отмечены зеленым и синим, характерных для дистрибьютора), который имеет немного больший диаметр, должны быть помещены в правой (рис. 3).
3. 1. Перемещение удары по х и у оси с помощью ручки регулировки XY. Правая ручка регулировки перемещает удары вдоль оси х и левой ручки регулировки перемещает удары по оси ординат.
      Существует цифровой дисплей микрометр по обе ручки регулировки. Они приводятся в действие при движении ручки.
   2. Сброс → нажмите ZERO / ABS кнопки.
      Переключение между дюйма и нажмите мм → В / мм кнопку.
      Расстояние между отверстиями должно быть 2,0 мм (измеряется между центрами отверстий) при использовании 1 мм удар для 9x8 шаблона.
4. 1. Для того, чтобы вы не подтолкнуть удар слишком далеко в блок, удар и уничтожить кассету удар, поставьте кассету без парафина в держатель и установить в нижнее положение получателя удар до 1 мм выше нижней части кассеты с помощью винтов глубину остановки вверхнем левом углу Z-направляющей (рис. 3).
   2. Положите получателя блока в держателе и использовать наименьшее отвертка для крепления винтами. Не затягивайте винты плотно или парафин может вырваться из кассеты.
   3. Нажмите получателя удар вниз приблизительно на 5 мм в получателю блока и использовать ручку в удар, чтобы повернуть удар и обратно один раз (рис. 3). Отверстие будет 5 мм в глубину при нажатии удар, как далеко вниз в блок, как это возможно.
   4. Сбросьте давление нажатием вниз медленно, так что источники могут перемещаться до удара. Используйте стилет, чтобы очистить удар и отбросить парафин ядра.
5. Перемещение башни, чтобы перейти к донорам удар (рис. 3).
6. Поместите мост донора блока с блоком доноров на держатель блока получателя (рис. 3).
7. 1. Нажмите доноров пункциич в выбранной области донорского блока. Используйте соответствующие гематоксилином и эозином окрашенных слайд, где область интереса был отмечен чтобы найти ткань, которая должна быть выборку. Вручную проводить донор блока в позицию с левой стороны и нажать на удар с правой рукой. Обратите внимание, что вы не должны нажимать на стилет. Ограничитель глубины не блокирует движение удар в правильное положение для донора блока, поэтому важно, чтобы вы прекратили нажатия, когда второй знак виден на стилет.
   2. Поверните ручку на удар один раз (рис. 3). Медленно отпустите давление вниз, продолжая удерживать доноров блока на мосту блока донора.
   3. Донорских тканей предпочтительно кулаками 0,5 мм короче, чем получатель ядра. Этот процесс будет обеспечить регулируемый выравнивание ядер на поверхности блока получателя, избежать потери ценной ткани представителя.
8. Удаление моста и доноров блока. ДелатьУбедитесь, что донор удар совмещен с отверстием, которое было сделано ранее (пункт 4). Вы должны изменить положение удар помощью установочных винтов, если удар доноров и отверстие в блоке получателя не совпадают.
9. Осторожно нажмите на удар вниз, пока его кончик достигает верхней части отверстие в блоке получателя. Удерживая это положение, используя стилет, чтобы очистить ткань ядро ​​в отверстие. Основная поверхность должна быть в соответствие с поверхности блока.
10. Перемещение башни к получателю удар.
11. Переход к следующей позиции с ручками регулировки XY.
12. Повторите с точки 4c выше, пока массив завершена.
13. Когда весь блок получателя закончена, ослабьте винты в держатель блока получателя. Выпекать блока в 42 ° C в течение 40 минут. Установите блок с секционирования область вниз на стекло. Поместите предметное стекло с блоком в верхней части держателя пробирку (или другого соответствующего строительства) и место в тОн духовку. После выпечки, снимите держатель пробирок из духовки и выровнять поверхность блока, осторожно поглаживая стекло.
14. Установите блок с стекло на пластины охлаждения в течение 10 минут.
    Для обеспечения представительства ткани по всему ТМА контроль качества на каждой ^50-й раздел выполняется.

3. Как Раздел ТМА (анимация 2)

1. Вырезать 4 мкм толстым слоем с помощью микротома с разделом системы передачи (HM 355S, Microm). Система может использоваться со всеми современными поворотный микротомы. Система состоит из лезвия носитель со встроенным мостом передачи, с подогревом на водяной бане и блок управления. С лезвием разделы скользят по мокрой поверхности передаче через передачи моста в водяной бане.
2. Разделы должны быть взяты из водяной бане сразу после того, как вытянул, чтобы избежать плавления чувствительные места ткани (например, липидный богатые ткани, как грудь и мозг). Пласе раздел на предметное стекло SuperFrost. Время разделах можно оставить в воде зависит от типа парафина воском используются и температуры воды. Наша лаборатория использованием парафина с HistoLab Products AB, которые имеют температуру плавления 56-58 ° C, и мы рекомендуем температуре воды ванны 37-39 ° С.
3. Поместите слайды в держатель слайдов для сушки при комнатной температуре (RT) за ночь.
4. Слайды, запеченная в 50 ° С в течение 12-24 часов. Использование microtom без STS у вас есть для перевозки на участке от лезвия на водяной бане вручную с помощью, например, кистью.

4. Тестирование и титрование для иммуногистохимии (Анимация 3)

Каждое антитело подвергается стандартной процедурой тестирования с использованием специально разработанных ТМА содержащей смесь тканей и различных типов клеток. Цель заключается в оценке личности и оптимизированный протокол окрашивания для каждого антитела. Первоначально одно разведение, основанное на муравьяibody акции концентрации первичного антитела испытания. Результаты этого теста окрашивания используется для дальнейшего руководства разведения и оптимизации протокола.

1. Депарафинизации и гидратации в ксилоле и градуированных этанола дистиллированной воды осуществляется до иммунной.
2. Блокирование шаг, чтобы утолить эндогенной пероксидазы выполняется в 0,3% H ₂ O ₂ в 95% этаноле в течение 5 минут.
3. Тепло Индуцированные Эпитоп поиска (HIER) выполняется в буфере рН поиска 6 с использованием давления котла (Decloaking камеры, Biocare Medical) в качестве источника тепла в течение 4 минут при 125 ° C. После завершения кипения, слайдов остаются в котел и дают остыть до 90 ° C. Общее время обработки HIER примерно 45 минут.
4. Если нет убедительных результатов получено в первоначальное испытание, дальнейшие испытания проводятся на основе наблюдаемой картины окрашивания ^{5 6.} Пилотное исследование, в рамках ГПК высокой пропускной способности ввода в эксплуатацию, показало,что наиболее полезно антиген поиска, где HIER рН 6, но и другие методы поиска, такие как предварительной инкубации с протеиназы, микроволновая печь и кипения в буфере с высоким или низким рН, конечно, могут быть использованы. При изменении условий, например, IHC изменению времени инкубации антитела, антитела, разведения и диаминобензидина (DAB) время инкубации окрашивания модель может дать более убедительные результаты.

5. Окраска Программы Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)

Все инкубации делается при комнатной температуре и этот протокол также может быть использован в качестве ручной настройки с теми же реагентами.

1. Промыть в промывочного буфера.
2. Инкубация с ультра блока V в течение 5 минут.
3. Промыть в промывочного буфера.
4. Инкубация с первичными антителами в течение 30 минут.
5. Промыть в промывочного буфера (x2).
6. Инкубация с надписью пероксидазой хрена-полимерный течение 30 минут.
7. Промыть в промывочного буфера (x2).
8. Развиваясь в решении DABв течение 10 минут.
9. Промыть в промывочного буфера (x2).
10. Counterstaining в Майерс гематоксилин в течение 5 минут *. При использовании прогрессивных методов окрашивания (например, Майерс гематоксилин) интенсивность зависит от времени и никаких различий не требуется. Регрессивный метод окраски, например, Харрис гематоксилин требует дифференциации для удаления избытка красителя из ткани для того, чтобы подчеркнуть структуру.
11. Промыть в водопроводной воде *.
12. Промойте в воде карбоната лития, разбавленного 1:05 из насыщенного раствора в течение 1 минуты *.
13. Промыть в проточной воде в течение 5 минут *.
14. Слайды обезвожены в градуированных этанола и слайды coverslipped (Pertex, Histolab)

Все реагенты, которые применяются в объеме 300 мкл на слайд.
* Шаги 10-14 сделаны в histostaining инструмент (Autostainer XL, Leica) и coverslipping дополнительно сделать в coverslipper системы (Automated coverslipper стекло CV5030, Leica).

6. Как сканироватьАвто

Метод сканирования слайдов зависит от цифрового сканера используются, это только протокол определяет, как для сканирования слайдов с использованием автоматизированной системы сканирования Aperio XT (Aperio технологий). В человеческий белок Атлас настройки 20x увеличением для тканей и 40x для клеток используется. Автоматическая проверка может столкнуться внимание проблемы, связанные с неоднородностью тканей и количество различных тканей, включенных в районе аэродрома.

1. Очистить стекло от грязи, клея и проверить пузырьков воздуха между покровным и секции. В случае ремонта воздушных пузырьков на слайде.
2. Поместите слайд в стойке и установите решетку на цифровой сканер. Время сканирования ТМА на 20x увеличение составляет около 6 минут. Программное обеспечение от Aperio используется для выбора области интереса. Выбор точки фокусировки осуществляется автоматически в программном обеспечении. Вручную выбора области сканирования и точки фокусировки также возможно.
3. После того, как изображение чкак была сформирована она может быть использована для оценки и аннотации окрашивания IHC. Изображения остаются в результате файл эксперимента и могут быть распределены с коллегами для обсуждения и в дальнейшем использоваться для публикации данных. Изображения можно просматривать в свободном доступе программное обеспечение Aperio.

7. Как найти любимую белков в человеческом Атлас белка

1. Обзор www.proteinatlas.org.
2. Введите имя вашего любимого белка, Ensembl идентификатор, UniProt инвентарный номер или название HGNC например, инсулин.
3. Введите сводной странице и прокрутите вниз до нормальных тканей и органов резюме. Этот обзор показывает экспрессии белка в поджелудочной железе.
4. Нажмите на кнопку "больше данных, ткань". Вы входите в нормальных тканях, посмотреть, где вы можете увидеть все ткани включены отсортированные по органа.
5. Нажмите на поджелудочную железу, чтобы просмотреть результаты ИГХ 3 антитела, направленные на то же белка. Для просмотра приветGH-разрешением поджелудочной железы мыши на изображение.
6. Дополнительная информация о экспрессии белков в раковых тканях, клетках и в дальнейшем проверки данных в человека Атлас белка можно найти, перейдя по ссылке человеческий белок Атлас сайта.

8. Представитель Результаты

Анимация 1. Как подготовить тканей для производства ткани микрочипов. Щелкните здесь для просмотра Анимация 1 .

Анимация 2. Как разделе ТМА. Щелкните здесь для просмотра анимации 2 .

Анимация 3. Иммуногистохимии техника описана. Щелкните здесь для просмотра Анимация 3 .

Рисунок 1. Общая схема процесса в человеческий белок Атлас Упсала.

Рисунок 2. Донор стилет отмечен для стандартизированной длине ткани ядра, например, 4,5 мм.

Рисунок 3. Руководство microarrayer ткани.

Рисунок 4. Примеры разного качества производимых ТМА. (А) прямой и выровнены ТМА достаточное пространство между строк и столбцов, а также к краю парафин. (B) ТМА с некоторыми из ядер слишком близко к краю в результате вероятных трудностей при секционирования. (C) ТМА которые были запеченные в тоо давно в результате свернутый ТМА без правильного шаблона.

Рисунок 5. Гематоксилин и эозин ТМА окрашенных. (А), надлежащим образом сократить раздел с прямыми и соответствие столбцов и строк. Использование плохих или грязных лезвия может привести к расщеплению (B) или сжатым разделам (В).

Рисунок 6. Титрования антител. (А) Реакция центре клетки лимфатических узлов показывает, оптимально титровать антитела в результате окрашивания специфическими цитоплазматическими (показаны коричневым цветом), без фона. (B) тканей разделе показаны слабые окрашивания. Отрицательная или слабо окрашивание происходит тогда, когда концентрация первичных антител слишком низкое или, если целевого белка нет в immunostained тканей. (C) тканей разделе overstained за счет использования слишком высокой концентрации первичных антител. ГКовчег цвета приводит к трудностям определения внутриклеточной локализации из-за перекинуться, перекрестной реактивности и ложноположительных.

Обсуждение

Иммуногистохимическое на сегодняшний день является наиболее часто используемых приложений для ТМА. Сочетание IHC и ТМА могут быть использованы в нескольких различных местах, например, высокопроизводительного скрининга белков экспрессии в тканях и ^{7 8 9 10} клеток, исследования биомаркеров открытие на основе образцов тканей большие когорты пациентов ^{11 12} и более фундаментальной биологии опухоли Исследования, в том числе различные фенотипы / генотипов, дифференциация стадий прогрессии и метастазированию ^13. Одно из преимуществ использования ТМА является то, что материал из большой когорты могут быть проанализированы в одно время, как сохранение ценных биологических материалов и обеспечения более воспроизводимые эксперименты. Кроме того, использование технологии ТМА экономит на реагент затраты и время лабораторной обработки. В ТМА содержит только ограниченное количество ткани, ткани гетерогенность является проблемой. В зависимости от типа ткани и вопросов, подлежащих рассмотрению, несколько образцов может потребоваться от одного specimeл. Для опухолевых тканей, использование от двух до четырех ядер от каждого образца рекомендуется, как было показано, что приводит к высокой степени точности в представлении целых участков тканей ^{13 14.} В зависимости от состава ткани диаметром ударов (от 0,6 мм до 2 мм) могут быть скорректированы. Ткани являются сложными и состоят как различные типы клеток, структур и внеклеточного матрикса. В состав каждого типа ткани, содержащей различное количество жира, кровеносных сосудов, соединительной ткани, хрящей и т.д., будут влиять на давление, необходимое для штамповки и сбора отдельных ядер. Поэтому важное значение для практики все этапы процедуры на материал, который не имеет никакой ценности, пока производство ТМА с определенным тканям для предполагаемого эксперимента.

Когда срезов различных тканей в пределах одного блока ТМА состав блока может повлиять на возможность приобретения высокой разделы качества. Сеrtain ткани, например кожи, костного мозга, жира, мозга и молочной железы, оказываем секционирования блока ТМА затруднена из-за влияния различий в структуре осуществления разделы как растянуть на водяной бане и как различной твердости режется лезвием и т.д. Поэтому рекомендуется, чтобы группа ткани с аналогичными функциями, например, липидный богатые ткани в одном районе аэродрома, когда это применимо. Большинство раком ткани в этом смысле однородными, что облегчает секционирования рака ТМА. Альтернативный метод секционирования для стабилизации микрочипов ядра могут быть использованы при работе с гетерогенными ТМА типов тканей. Использование клейкой ленты может быть полезно, чтобы избежать потери ядер и выпадения в секционного ТМА. Использования клейкой ленты следует применять с осторожностью, поскольку ленты может повлиять на толщину секционного ядра, а затем и результат окрашивания IHC ^15. В человеческий белок Атлас настройки шаблона ТМА из 9x8 (без маркеров) ядра арE используется. Важно, чтобы получить максимальное количество разделов и хранить все ткани представлены во всем блоке. Для экономии реагентов и время сканирования, 2 секции располагаются на одном стекле позволяет максимально шаблону 9x8.

Основным хранилищем для белка информации, Universal ¹⁶ ресурсов белка включает в себя около 20,300 человек отзывы записи белков, из которых только около 66% есть доказательства, на белковом уровне. Кроме того, для большинства генов, для которых имеются данные о существовании на уровне белка, существует очень мало или нет информации о функции белков и распределения выражения. Важной задачей на будущее является анализ картины распределения и относительного обилия этих неизвестных белков в различные типы тканей человека. Информации из баз данных, таких как Uniprot, Ensembl, опубликованных данных PubMed может быть использована в качестве руководства по созданию моделей, если иммуногистохимического окрашивания с использованием антител кпалатах неизвестные белки представляют собой реальные профили белок предназначен целевого белка. Кроме того, ряд других стратегий проверки необходимы, чтобы обеспечить функциональность антител, например, антитела, функциональные белки массивы, Вестерн-блот, иммунофлюоресценции, иммуно-и осадки выпадающие экспериментов. Пожалуй, самым важным инструментом для проверки антител функциональности является использование парных антител, то есть два разных антител против отдельных, неперекрывающихся эпитопов на том же белка-мишени, сравнить анализ конкретных результатов ^17.

На основе собранной информации, антитела тестируются и титровать по IHC стандарты и опыт тестирования и проверки на 35,000 антител человека проект белка Atlas. Более 20% всех генов белков профилей, данные из парных антител (2 или более антител к неперекрывающихся эпитопов на тот же белок) был использован для определения лучших оценкаммат соответствующей выражению белка. Парные антитела обеспечивают конечной стратегии для проверки конкретных иммуногистохимии на основе модели экспрессии белка. Эта стратегия является ценным, потому что множество различных тканей, включенных в основной отбор увеличивает риск перекрестной реактивности. Следует также отметить, что некоторые ткани в целом более склонны, чтобы показать фон окраски, например, макрофаги, гладкие мышцы, в дистальных канальцев почек и гепатоцитов в печени. Дополнительные вопросы, которые следует рассмотреть изменения в технике обработки ткани с течением времени для тканей, взятых из архивных материалов, которые могут привести к ложным отрицательным или ненадлежащее положительное окрашивание модели IHC. Это явление встречается и в большом аналитическом разделе. Положительные и отрицательные контроля являются жизненно важными и должны быть использованы по мере возможности. Для более глубокого исследования, включая функциональный анализ, клеточные линии с принудительным выражения и конкретные нокдаун соответствующих трanscripts (миРНК технологии) могут быть использованы для создания элементов управления. Для получения оптимальных результатов в IHC, важно, чтобы проверить и использовать системы поиска антигена, так как формалин фиксации вызывает различные химические модификации, например, сшивание, гидролиз Шиффа маскировка антигена ^18.

В заключение, на основе антител протеомики использовании ТМА технологии и IHC является мощной стратегией для генерации данных экспрессии белка в больших масштабах. Белки человека Атлас проект был создан, чтобы создать карту человеческого выражения белка в нормальных тканях человека и рака. Целью данного проекта является презентация первого проекта всеобъемлющего человека Атлас белка к 2015 году. В дополнение к предоставлению белок профилей в нормальных органов и тканей, эти усилия также является отправной точкой для биомедицинских исследовательских проектов, в том числе клинических усилия открытие биомаркеров. Конечная цель заключается в добавлении следующего слоя информации в верхней части человеческого генома, что шбудете иметь решающее значение для более глубокого понимания биологии, лежащие в основе различных болезненных состояний, а также послужит основой для разработки новых диагностических и терапевтических средств.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Вымойте буфер	Thermo Fisher Scientific	TA-999-TT
Цитратный буфер pH6	Thermo Fisher Scientific	TA-250-Pm1X
Антитела разбавителя	Thermo Fisher Scientific	TA-125-UD
Ультравижин LP HRP полимеров	Thermo Fisher Scientific	TL-125-HL
DAB плюс подложка	Thermo Fisher Scientific	TA-125-HDX
Ultra V Блок	Thermo Fisher Scientific	TA-125-UB
Первичные антитела Enhancer	Thermo Fisher Scientific	TL-125-PB
Майерс гематоксилин	HistolAB	01820
Pertex	Histolab	00871.0500
Наименование оборудования	Компания	Номер по каталогу
Руководство ткани микро arrayer	Estigen, Бичер-инструмент	MTA-1
Водопад микротома	Thermo Fisher Scientific	Microm HM 355S
Автоматизированный сканер скачать	Aperio технологии	XT
Автоматизированная система окрашивания слайдов	Thermo Fisher Scientific	Autostainer 480S-2D
Автоматизированная система окрашивания слайд deparafinization и обезвоживание	Leica Biosystems	Autostainer XL
Автоматизированная coverslipper стекла	Leica Biosystems	CV5030
Decloaking камеры	Biocare Медицинское	DC2008INTEL