$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Инкубируйте куриных и перепелиных яиц желаемый этап
Для HH9 эмбрионов, типичное время инкубации составляет от 29-33 часов при 38 ° C. 63
- Смойте остатки из яиц с теплой водой.
- Упорядочить куриные яйца на подносе по горизонтали. Отметить вверх с карандашом, это будет соответствовать той области, где эмбрион будет локализована. Инкубировать перепелиные яйца тупым концом вверх.
- Место в 38 ° C увлажненном инкубаторе. Включите функцию качания.
2. Подготовка яиц для окон и вскрытия
- Удалите яйца из инкубатора, и стерилизовать вершины с 70% этанола. Лучше всего распылять на этанол и стереть ее быстро с бумажным полотенцем или Kimwipe, чтобы избежать поглощения этанола через яичную скорлупу.
- Место куриные яйца на отдельный держатель яйцо (мы используем чашке Петри выстроились со сложенными бумажные полотенца, например, "Kimwipes"). Используя щипцы А.А., нажмите небольшой холе на верхней поверхности скорлупы на остром конце яйца.
- Удалить 3 мл 1,5 света альбумина с куриное яйцо с 18 ½ G иглой подкожно и 5 мл шприц. Лучше всего вставить иглу вертикально в отверстие с конической перед заостренный конец яйца (рис. 2A). Таким образом, когда альбумина сняты, есть небольшой риск случайно повредить желток с помощью всасывания. Откажитесь от альбумина. Этот шаг позволит снизить желток и зародыш в яйце, чтобы обеспечить окно будет открыто в яичной скорлупе.
- Протрите отверстие с 70% этанолом, как описано выше и скрепите скотчем. Важно, что яичная скорлупа окружающих отверстие полностью лишена альбумина и сухой или клей не запечатать.
- С щипцы А.А., нажмите еще одну дыру в отмеченной верхней поверхности горизонтальной яйца, не совсем на вершине. Будьте осторожны, чтобы не допустить щипцы заходить слишком далеко через яичную скорлупу, чтобы не повредить желток или эмбриона.
- ВСерт одной стороны изогнутый пинцет ирис в отверстие параллельно яиц. Сжатие вниз на корпусе, работающий в круговое движение, чтобы сломать ~ 2 см в диаметре окна в оболочке яйца куриные. Отменить удалить скорлупу. Кроме того, покрытие верхней поверхности яйца с упаковочной ленты и использовать ножницы, чтобы вырезать окно. Это сводит к минимуму вероятность падения обломков скорлупы в яйце. Эмбрион должен появиться как непрозрачный диск на верхней части желтка. Откажитесь от любого неоплодотворенных яиц (определенные небольшие белые пятна на поверхности желтка или отсутствие бластодерма).
- Вводите небольшое количество тушь (разбавленный 1:10 в стерильного раствора Рингера, содержащие "Pen / Strep" антибиотик: конечная концентрация 100 мкг / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) под бластодерма для оказания помощи в постановке эмбриона. Используйте 1 мл шприц и 26 ½ G шприц, согнувшись в 45 ° у основания иглы, с конической вверх, наоборот, одна маУ использовать вытащил стекло пипеткой Пастера и рот пипеткой аппарата (надевайте защитные очки при изгибе шприц или игла разбитого стекла). Прокол мембраны желток за пределами периметра бластодерма и вставьте кончик иглы под эмбриона, близких к поверхности желтка, но не в зародышевых листков (рис. 2В). Вводите достаточно чернил, чтобы наметить эмбриона, затем осторожно снять иглу (рис. 2). Потребители инъекционных слишком много чернил может привести к смерти эмбриона. Важно, чтобы не вводить любые воздушные пузыри под эмбриона, так как это может быть источником заражения. Примечание: Все решения Рингера, используемых в этой процедуре стерилизации и содержит Pen / Острый, как указано выше. Стерильный фосфатный буферный раствор (PBS) также является приемлемой альтернативой раствор Рингера на всех этапах этого протокола.
- Этап эмбриона в соответствии с Гамбургер и Гамильтон 63 и записать сцену на яичной скорлупы в несмываемыми чернилами или карандашом. Этапы лучше всего оценивать по стерomicroscopy с волоконно-оптической "гусиная шея" источников света, которые имеют ограниченный тепловой нагрузки.
- Нанесите 2-3 капли теплого стерильного решение Рингера на поверхности эмбриона, чтобы избежать обезвоживания и загрязнения. Временное уплотнение окна с парафильмом растягивается по поверхности яйца.
- Повторите шаги 2.2-2.9 со всеми куриных яиц перед началом пересадки экспериментов.
- С перепелиным эмбрионов будут использованы только для донорских тканей, в ово шаги 2.2-2.9 может быть опущен. Для бывших ово подготовки доноров эмбрионов, перепелиные яйца инкубируют тупой стороной вверх и открыл в этом регионе с изогнутыми щипцами выявить эмбрион. Использование рассечение ножницами, сделать четыре сокращений в форме квадрата через мембрану желточного и бластодерма вне эмбриона (убедитесь, что все сокращения встречаются). Использование изогнутых щипцов ириса, нежно схватить одного разреза края и поднять эмбриона из яйцеклетки и перенести его на Рингера раствор в чашке Петри. Кроме того, можно использовать кривуюг ириса щипцы для снятия вырезали зародыш снизу, или эмбрион ложкой или пластмассовой пипетки передачи прорубить широкую часть цилиндра, могут быть использованы для передачи эмбриона из яйцеклетки. Аккуратно снимите желточной мембраны с 5 щипцы. Соберите оставшиеся эмбрионы перепела, как указано выше, и поставить их под микроскоп рассечения.
3. Подготовка принимающей эмбриона для получения трансплантата
- Удалить парафильмом от хозяина (куриного) эмбриона и использование заостренной иглы вольфрама или 5 щипцы, рвать небольшое отверстие в мембране желточной в нужной области нервной трубки (рис. 3А).
- Добавить каплю раствора Рингера в зародыше. Позаботьтесь, чтобы сохранить эмбрион полностью погружен в раствор Рингера в течение всей процедуры, чтобы предотвратить обезвоживание тканей. Продолжайте добавлять капли раствора Рингера на поверхности эмбриона путем передачи пипетки, если необходимо.
- Использование стекла вытащил иглу, осторожно сделать ростральной и околоudal поперечные разрезы, соответствующей длине и область интереса в спинной нервной трубки. (Вытащил иглы стекла формируются из кремния стеклянные капилляры, которые были выведены под воздействием высокой температуры с помощью иглы тянуть аппарат.) Для одностороннего трансплантатов разрезы должны распространяться лишь на просвет спинной нервной трубки, так и для двусторонних трансплантатов, сделать надрезы по всей весь спинной нервной трубки. Затем вырежьте на двусторонней основе между спинной нервной трубки и параксиальной мезодермы.
- Аккуратно отделить вырезали эксплантов из нервной трубки, то удалить его из эмбриона аспирационных в стакан микропипетки (рис. 3В).
4. Подготовка донорской ткани трансплантата
- Выберите стадии соответствует перепелов эмбриона. Держите эмбриона вниз щипцами А.А., удалить желточной оболочки, а также акцизные аналогичного размера области нервной трубки, как описано выше (3,3-3,4) (рис. 3A'-B). В зависимости от потребностей эксперимента, эта область может бытьдополнительные области узла (цыпленок) нервной трубки или из другого региона по-ростро хвостовой оси. (Примечание: для более крупных региональных прививок, в том числе полное нейронных трансплантатов трубки, исследователи, возможно, пожелают добавить протеазы пищеварения на этот шаг, чтобы удалить любой приверженец мезенхимальных тканей от донора ткани до трансплантации, однако, для малых спинной нервный трансплантат трубки на ранних стадиях. , как описанные здесь, протеазы пищеварение не нужно, как нервная трубка легко отделяется от соседних мезенхимы строго хирургических методов.)
5. Graft ткани
- Аспирируйте доноров эксплантов в стеклянной пипетки с раствором Рингера. Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырьков в пипетку.
- Передача эксплантов, прилегающих к вырезали области куриных хозяина. Использование стекла вытащил иглу, ориентироваться эксплантов и осторожно направлять его в удаленной области (рис. 3).
- Осторожно добавьте несколько капель раствора Рингерана эмбрион, чтобы предотвратить обезвоживание. Будьте осторожны, чтобы не уронить жидкость непосредственно на трансплантат сайта, поскольку это может выбить трансплантата.
- Закройте окно с упаковочной лентой. Убедитесь, что лента уплотнения всей области оконного яйца. Это предотвращает обезвоживание и загрязнение зародыша во время последующей инкубации.
- Вернуться яйцо в инкубатор до нужной стадии. Убедитесь, что "качалка" функция отключена при инкубации химеры. Яйца могут быть слегка повернут на руки два раза в день, поскольку это может увеличить свою жизнеспособность, если более поздних стадиях развития ориентированы.
6. Подготовить химерных эмбрионов для секционирования
- В экспериментальных конечную точку, отрезать ленту, закрывающую окно с помощью тонких ножниц.
- Возьмитесь за край бластодерма с изогнутым пинцетом диафрагмы (проще всего сделать с зубчатыми советов), а затем вырезать эмбриона от желтка с 4 больших сокращений за пределами бластодерма. Передача эмбриона к чашке Петри с раствором Рингера. Позаботьтесь, чтобы минимизировать воздействие на эмбрион в воздух для того, чтобы избежать обезвоживания тканей.
- Под стереомикроскопия, осторожно отделить желточной оболочки с использованием бластодерма # 5 щипцы.
- Тщательно организовать эмбриона в блюдо так, что эмбрион в ту же ориентацию, как это было в яйце, с окружающими мембраны изложены квартире.
- Используйте рассечения иглы из 64 вольфрамовых проводов начисто удалить окружающих бластодерма из эмбриона путем организации иглу на границе зародыш и внеэмбриональной ткани, длиной параллельного вольфрамовой проволоки на дно тарелки. Используйте нежное движение пиления, чтобы прорваться через ткань.
- Осторожно снимите амнион с 5 щипцы. В этот момент вы можете, хотите или дальнейшего анализировать область ваших интересов, или оставить эмбрион целом.
- Передача эмбриона ледяной 4% парафиновойormaldehyde и рок ночи при 4 ° C.
- Подготовка образцов и вставлять для секционирования крио-или парафин.
Проследите пересаженной ткани в принимающей эмбриона. Есть несколько методов для определения перепелов в ткани куриного эмбриона, в том числе выявление перепела ядрышки окрашиванием гематоксилином (перепел ядра имеют очень большие, темные окрашивание включений, чем куриных зародышей), Фельгена-Rossenbeck реакции, акридиновым-оранжевым или бизнес-бензамид пятно в сочетании с электронной микроскопией, или immunolabeling для перепелов антигенов 3,47,65,66. Здесь мы используем антиген QCPN и стандартные целом монтажа или раздел иммунофлюоресценции методы для определения перепелиных клеток нервного гребня в перепелиных-птенец химеры (рис. 4). Эта технология обеспечивает максимальную гибкость в опытно-конструкторских, а иммунофлюоресценции QCPN также может быть объединена с другими антителами для определения дифференцированных клеток, полученных от донора (перепел) тканей. Используйте Standaго целого монтажа или методы иммунофлюоресценции разделе для обозначения перепелиных клеток, полученных в химеры.
7. Представитель Результаты
Представитель образ привиты области нервной трубки после 6ч повторной инкубации (в HH11) показывает, ожидается включение привитых доноров (перепел) ткани в хост (цыпленок) нервной трубки (рис. 4а). Эмбрионы показывает неполной интеграции трансплантата, или асимметричным развитием черепной или сомитов после reincubation должен быть уничтожен.
Поперечное сечение через привитые области на HH11 шоу НКЦ меченных HNK-1 миграции сбоку от нервной трубки. Перепела клетки способствуют NCC миграционных потоков, а также нервной трубки, четко обозначены с QCPN (рис. 4В).
На более поздних стадиях, перепелиные NCC-клеток, полученных можно проследить до их окончательного ткани цели. QCPN меченых клеток перемежаются в мезенхимы куриного эмбрионаверхнечелюстной процесса в E5 (рис. 4С).
Антитела QCPN можно легко комбинировать с другими антителами для изучения дифференциации перепела производных НКЦ в принимающей среде. Перепела NCC-производных тройничного сенсорных нейронов помечены QCPN и Tuj1 антител (Рис. 4D).

Рисунок 1. Обзор экспериментальной процедуры и необходимые инструменты.) Host (куриных) и доноров (перепел) эмбрионы должны быть этапе совпадают. Чтобы пометить поток NCC, которая способствует тройничный ганглий и челюстно-нижнечелюстной области, HH9 идеально. В HH9, нервная трубка начинает закрываться в ростральной области, но еще не полностью решена. Серая линия на графиках представляет средней линии закрытия нервной трубки. Пунктирные белые линии указывают на сокращение линии для вырезания области мозга с правой стороны нервной трубки от хозяина и донора етbryos. Исключены регионе принимающей зародыш удаляют, а пересадить донорские ткани для создания в химерных эмбрионов. Б) Необходимые документы: а) 5 мл шприц с 18 ½ G шприц, б) 1 мл шприц с 26 ½ G шприц изогнутый под углом 45 °, в) тушью, г) ясно упаковочную ленту, е), стеклянной пипетки ртом пипетки аппарата, е) 60 мм-Петри, г) А. А. щипцы, ч) изогнутый пинцет ирис с зубчатыми советы, я) # 5 щипцы, у) декоративные ножницы, к), заостренные вольфрамовой проволоки, л) вытащил стекло иглой, м) парафильмом квадратов.

Рисунок 2. Подготовка яиц и эмбрионов.) Поперечного сечения диаграммы яйцо, в том числе идеальная точка вставки 18 ½ G шприц для вывода легких альбумина. Б) После снятия ~ 3 мл света альбумин, желток и зародыш снижает внутри яйца, позволяя исследователям сократить «окно» (стрелки) в тОн яичной скорлупы для доступа к эмбриону. Тушь, разбавленное 1:10 в стерильного раствора Рингера, может быть введен под бластодерма обеспечить контраст для удобства постановки эмбрионов. C) куриного эмбриона после красочного.

Рисунок 3. Схема и примеры HH этап 9 донора и реципиента эмбрионов на каждом этапе процедуры пересадки.) Chick хозяин эмбриона. Пунктирные линии на диаграмме указано, где желточной оболочки должны быть разорваны на доступ к черепной части для пересадки. Когда разрывается треугольный лоскут желточной оболочки должны быть очищены каудально. Box в изображении указывает вставка используется в (ВС). ») Перепела доноров эмбрионов. Изображение донорского эмбриона вырезали из яйца и помещают в чашку Петри для рассечения тканей трансплантата. Box в изображении указывает вставка используется в (B). Пунктирные линии на схеме (А ') указывают, где желточного и желток мембраны должны быть сокращены для того, чтобы удалить тОн эмбриона из яйцеклетки. B) Host эмбрион с односторонним области мозга нервной трубки вырезают (белые стрелки) ожидает трансплантата. Пунктирная линия на схеме показывает, где сокращения должны быть направлены на акцизные нервной трубки в среднем мозге региона. ) B 'доноров эмбрионов с спинной нервной ткани трансплантата трубки вырезают (трансплантат тканей показано черными стрелками). Пунктирная линия на рисунке показывает, где сокращения должны быть сделаны в перепелиных эмбрионов акцизными тканей донора для одностороннего прививки мозга области нервной трубки. C) химерические эмбрионов после пересадки спинного перепела нейронных эксплантов трубки в области среднего мозга цыпленка.

Рисунок 4. Иммунофлуоресценции обнаружения перепела конкретных ядерных QCPN антигена донора клеток, полученных в химерных эмбрионов.) Всего монтажа изображения HH11 химера (привитые на HH9) с указанием QCPN окрашивание в красный и HNK-1 окрашивания (маркер миграции НКЦ) взеленый. 10х увеличение, вид сверху. Б) Сечение через эмбриона в (A), показывая QCPN-положительных перепелов, полученных клеток в нервной трубки и миграционных NCC совместно окрашивали HNK-1 (зеленый). 40-кратном увеличении. C) поперечное сечение верхней челюсти процесс E5 химера (инкубируют в течение 3 дней после трансплантата), показывая QCPN-положительных NCC-клеток, полученных (красный), которые мигрировали из привитых области нервной трубки до их окончательного места в зародыше. 10-кратным увеличением. D) Раздел через E5 химера показывающие вклад перепелов, полученных НКК тройничный ганглий (красный) и дифференциации в TuJ1-позитивных нейронов (зеленый). 40-кратном увеличении. * НКЦ, депутат, верхнечелюстной процесса; NT, нервная трубка, ТГ, тройничный ганглий.