Методическая статья

В пробирке Ассамблеи Semi-искусственные молекулярные машины и его использование для обнаружения повреждений ДНК

DOI:

10.3791/3628

⸱

11 января 2012 г.

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем сборки и применения молекулярного масштаба устройство питается от топоизомеразы белка. Конструкция био-молекулярных датчиков, какие метки два основных типа разрывов ДНК в срезах тканей путем присоединения двух различных флуорофоров в их конец.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Природные биомолекулярные машины функционируют в каждой живой клетке и обладают разнообразным строением 1-6. Тем не менее, разработка искусственных молекулярных машин сосредоточена на устройствах, способных к направленному движению, т. е. молекулярных моторах, и их миниатюрных механических деталях (колесах, осях, подвесах и т. д.) 7-9. Это имитирует макроскопические машины, хотя физические свойства, имеющие решающее значение для таких устройств, такие как инерция и закон сохранения импульса, неприменимы в условиях наномира 10. Альтернативные конструкции, которые не следуют схемам механических макромашин и используют механизмы, развившиеся в ходе эволюции биологических молекул, могут извлекать выгоду из специфических условий наномира. Кроме того, адаптация реальных биологических молекул для целей нанодизайна снижает потенциальные опасности, которые могут представлять продукты нанотехнологий. Здесь мы демонстрируем сборку и применение одной из таких биоинспирированных конструкций — полуискусственного молекулярного устройства, объединяющего природную молекулярную машину с искусственными компонентами. С точки зрения энзимологии наша конструкция представляет собой дизайнерский флуоресцентный комплекс фермент-субстрат, созданный для выполнения конкретной полезной функции. Эта сборка по определению является молекулярной машиной, так как содержит одну такую единицу 12. Однако ее интеграция с модифицированной частью — флуоресцентной двойной шпилькой — перенаправляет ее на новую задачу по маркировке повреждений DNA12.

Наша конструкция собирается из 32-мерной ДНК и фермента вакциниальной топоизомеразы I (VACC TOPO). Затем эта «машина» использует собственный материал для создания двух флуоресцентно меченных детектирующих единиц (Рисунок 1). Одна из единиц (зеленая флуоресценция) несет VACC TOPO, ковалентно прикрепленную к 3'-концу, а другая единица (красная флуоресценция) представляет собой свободную шпильку с терминальной 3'OH-группой. Эти единицы короткоживущие и быстро реассемблируются обратно в исходную конструкцию, которая впоследствии подвергается повтовному расщеплению. В отсутствие разрывов ДНК эти две единицы непрерывно разделяются и снова лигируются циклическим образом. В срезах тканей с поврежденной ДНК детектирующий блок, содержащий топоизомеразу, селективно присоединяется к тупоконечным разрывам ДНК с 5'OH (разрывы типа ДНКазы II)11,12, обеспечивая их флуоресцентную метку. Вторая, не содержащая фермента шпилька, образовавшаяся после расщепления олигонуклеотида, будет лигироваться с тупоконечным разрывом с 5'PO4 (разрывы типа ДНКазы I)11,12, если в растворе присутствует Т4-ДНК-лигаза 13,14. При добавлении Т4-ДНК-лигазы к срезу ткани или раствору, содержащему ДНК с тупоконечными разрывами 5'PO4, лигаза вступает в реакцию с 5'PO4-концами ДНК, образуя полустабильные комплексы фермент-ДНК. Тупоконечные шпильки будут взаимодействовать с этими комплексами, высвобождая лигазу и ковалентно связывая шпильки с ДНК, тем самым маркируя тупоконечные разрывы ДНК с 5'PO4.

Данная разработка представляет собой новый практический подход к проектированию молекулярных машин и служит полезным сенсором для обнаружения апоптоза и повреждений ДНК в фиксированных клетках и тканях.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разделы для молекулярной машины основе обнаружения должен быть подготовлен, так как их подготовка занимает больше времени, чем сборка молекулярные устройства. Построить хорошо работает с 5-6 мкм толщиной разделы, вырезанные из параформальдегида-фиксированных, парафин блоков ткани. Использование слайд брендов, которые сохраняют разделы, например, такие как ProbeOn Плюс заряжать и precleaned слайдов (Fisher Scientific) или аналогичный. Мы рекомендуем при первом использовании ткани с хорошо известной модели повреждений ДНК, которая содержит как ДНКазы I-и II-ДНКазы типа разрывов, такие как дексаметазон обработанных апоптоза крысы тимуса 13,14.

1. Подготовка разделов

  1. Место секций в стойку слайдов и депарафинизировать в ксилоле в течение 15 мин, трансфер в свежей ванне ксилол для дополнительных 5 минут.
  2. Увлажняет, проходя через градуированные концентрации этанола: 96% этанол-2x5min; 80% этанола - 5 минут, вода - 2x5 мин.
  3. Дайджест раздела ProteinasИспользование электронной К. 100 мкл 50μg/mL раствора на секции. Инкубировать 15 'при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере. Время, возможно, потребуется корректировка в зависимости от типа ткани. Жесткий тканей может потребоваться больше пищеварения. Времена 15-25 мин, как правило, используется. Недостаточность пищеварения, может привести к более слабым сигналом. Избытком, с другой стороны результаты в исчезновении сигнала и раздел разрушения.
  4. Промыть в дистиллированной воде в течение 2х10 мин.
  5. Применить 100 мкл на раздел 2% БСА для preblocking. Инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (23 ° С). За это время собирать молекулярные машины.

2. Молекулярная сборка машин

Все реагенты масштабируются на 25 мкл общего объема, что достаточно для одной обнаружения в среднем срез ткани размера (10x10 мм). Объем может быть расширен по мере необходимости.

  1. Комбинат в небольшой пластиковой трубки в таком порядке:
  1. Бидистиллированной воды;
  2. 15% полиэтиленгликоля-8000;
  3. Решение 66 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 0,1 ммоль dithioerythritol, 1 мМ АТФ (т.е. регулярные T4 ДНК-лигазы буфера);
  4. 70 пмоль олигонуклеотидных 1,
  5. 215 пмоль (1,76 - 7,1 мкг) VACC TOPO
  6. 10 единиц T4 ДНК-лигазы (500 ЕД / мл)
  1. Осторожно перемешать с помощью пипетки. Молекулярной построить почти мгновенно самостоятельно собирает в этом растворе и может быть использован сразу при комнатной температуре (23 ° С). Повышение температуры до 37 ° C блоков Т4 ДНК-лигазы-компоненте маркировки.

3. Использование молекулярных машин, в срезах тканей двойного 5'OH этикетки и 5'PO4 разрывов ДНК

  1. Аспирируйте preblocking решение и применить 25 мкл полной смеси реакции, содержащие 70 пмоль олигонуклеотидных 1, 53 - 215 пмоль (1,76 - 7,1 мкг) VACCTOPO и 10 единиц T4 ДНК-лигазы (500 Ед / мл) в растворе из 66 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 0,1 ммоль dithioerythritol, 1 мМ АТФ, а 15% полиэтиленгликоля-8000. Же олигонуклеотидных последовательностей проведения одного FITC этикетки, олигонуклеотидов 2, может быть использован вместо для обнаружения одного типа разрывов ДНК. В таком случае опустить лигазы от маркировки реакции. Кроме того, в этой ситуации решение 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 15% ПЭГ-8000 может быть использован вместо Т4 ДНК-лигазы буфера.
  2. Выдержите в течение 1 часа при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере с пластиковыми покровным. Защищать от света. Понижение температуры до 16 ° C снижает лигазы основе сигнала, повышение температуры до 37 ° C полностью исключает лигазы основе сигнала. Частичное торможение лигазы иногда происходит в реакционную смесь, возможно, из-за загрязнения введена топоизомеразы препаратов. Таким образом, больше инкубационный (2-4 часов) может потребоваться особенно, когда сignificant числа лигазы меченных перерывы присутствуют. Хотя оба лигазы и топологический сигналы можно наблюдать на данном этапе, во многих случаях лигазы сигнал может быть дополнена путем повторного применения реакционной смеси без VACC TOPO и двойного меченых олигонуклеотидов, но содержащие шпильки формы олигонуклеотида (олигонуклеотидов 3) (35 мг / мл) и T4 ДНК-лигазы (250 ЕД / мл). Для усиления сигнала перейдите к шагу 3, чтобы увидеть реакцию без повышения перейдите к шагу 5.
  3. Удалить покровные, осторожно погружая слайды вертикально в банку Коплин содержащих воду при комнатной температуре. Аспирируйте лишнюю воду.
  4. Повышение лигазы сигнала с применением 25 мкл реакционной смеси без VACC TOPO и олигонуклеотида 1, но содержащих олигонуклеотидов 3: 66 мм-Tris HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl 2, 0,1 ммоль dithioerythritol, 1 мМ АТФ, а 15% полиэтиленгликоля- 8000, 5 единиц T4 ДНК-лигазы, 35 мг / мл олигонуклеотидов 3 (тупыми концами шпильки). Общий объем решение маркировки окн быть расширены для размещения больших разделов. Инкубируйте в течение 18 часов (на ночь) при комнатной температуре (23 ° С) во влажной камере с пластиковыми покровным.
  5. Удалить покровные, осторожно погружая слайды вертикально в Коплин сосуд, содержащий воду при комнатной температуре. Затем промыть разделе 3х10 мин в дистиллированной воде.
  6. Промыть натрия бикарбоната буфера. Щелочной раствор полоскания улучшает FITC флуоресценции, которая рН чувствительной и значительно снижается ниже рН 7.
  7. Защитный кожух с antifading решение (Vectashield с DAPI), покровное и анализа сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа. Дважды цепи ДНК порывает с 5'OH будут светиться зеленым, 5'PO 4 отдых - будут светиться красным (рис. 2).

4. Представитель Результаты

figure-protocol-1
Рисунок 1. Полу-искусственные молекулярные машины определяет два типаПовреждение ДНК на месте. Флуоресцентные машины самостоятельно собирает, когда VACC ТОПО связывается с двойным шпильки 32-Мер. Машина начинает работать, разделив себя на два блока детекторов с помощью топоизомеразы производства сократить на конец 3 'узнаваемой последовательности. Это приводит к циклическим процессом, в котором FITC-меченого единица непрерывно разделяет и religates обратно родамин-меченого единицы. Это сохраняется до перерыва обнаружить ДНК встречается. Когда такой альтернативный акцептор (5'OH тупым разрыв ДНК конца) присутствует в тканях разделе FITC часть будет перевязывать к нему. Остальные родамина часть будет приложить к 5 'PO 4 ДНК тупой конец перерывы с помощью T4 ДНК-лигазы. Следовательно, оба типа разрывов ДНК одновременно обнаружено.

figure-protocol-2

Рисунок 2. Молекулярная машина двойного этикетки двух типов разрывов ДНКв срез ткани дексаметазона обработанных тимуса. Блант состава ДНК разрывы ДНКазы I-и II-ДНКазы типа обнаружены в областях коры тимуса апоптоза. Зеленый цитоплазматических флуоресценции (5'OH разрывов ДНК) знаменует корковых макрофаги переваривают ядерный материал апоптоза тимоцитов. Этот сигнал вырабатывается VACC TOPO и локализуется в phagolysosomes с ДНК, содержащей 5'OH двунитевых разрывов 11,12. Красный флуоресценции (5'PO 4 перерывами) этикетки ядер апоптоза тимоцитов не охвачен макрофагов. Массивные числа тимоцитов одновременно подвергаются апоптозу сопровождается генерацией 5'PO 4 двунитевых разрывов, визуализируются с помощью лигазы основе маркировки. Эти разрывы находятся на периферии ядра, образуя кольцевые узоры. Все клеточных ядер визуализируются на counterstaining с DAPI (синий флуоресценции).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео показано, как собрать и использовать двойной маркировки повреждений ДНК датчика. Датчик молекулярная машина управляется био-молекулярных двигателей, вирус-закодированного белка VACC ТОПО связаны с искусственным компонентов. Представлен пример развития био-включен подход, сторонники адаптации биологических структур, архитектуры и фактической части и компоненты клеток к дизайну нетоксичных молекулярных устройств масштаба 12,15. Такой подход решает две проблемы присущи области в естественных усл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом R01NS062842 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальные институты здравоохранения (ВСД) и грантами R21 NS064403 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальные институты здравоохранения через ARRA (ВСД) и R21 EB006301 Национального Института биомедицинской визуализации и биоинженерии, Национальные институты здравоохранения (ВСД).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

  1. Ксилол
  2. 80 и 96% этанола.
  3. 2% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) в дистиллированной воде.
  4. Олигонуклеотидов 1: дважды шпильки, двойные помечены флуоресцеина и tetramethylrhodamine:

5'-AAG GGA CCT GC F GCA ГГТ CCC TTA АЧГ КПП R AT GCG ТТ-3 ', F - FITC-DT; R - Tetramethylrhodamine-дТ. Другие красное смещение флуорофоров, таких как BODIPY TR, родамин или TAMRA может быть использован вместо tetramethylrhodamine как R.

Также вы можете использовать олигонуклеотидов 2 -. Дважды одну шпильку помечены флуоресцеина (для выявления одного типа разрывов ДНК (ДНКазы II типа только) одного флуорофора несущих зонда значительно дешевле, и удобно, когда одна тип ДНК перерыв, подлежащих маркировке: 5'-AAG GGA CCT GC F GCA ГГТ CCC TTA АЧГ CAT ATG ВКТ Т-3 ', F - FITC-дТ

  1. Олигонуклеотидов 3. Блант состава родамин-меченого шпильки для повышения сигнала на месте перевязки с T4 ДНК-лигазы: 5'-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 ', R - Tetramethylrhodamine-дТ
  2. Vaccinia ДНК топоизомеразы л (VACC ТОПО) - 3000 ед / мкл (Vivid Technologies). В первых экспериментах мы использовали 215 пмоль (7,1 мкг) VACC TOPO на каждые 25 мкл реакционной смеси. Тем не менее, топоизомеразы концентрация может быть значительно уменьшена без потери чувствительности. Позже мы использовали четыре раза меньшее количество VACC TOPO в разделе (1,76 мкг в 25 мкл реакционной смеси в каждой секции) с аналогичными результатами. Сокращение количества фермента до 880 нг (в 25 мкл реакционной смеси) привело к более слабым сигналом и 8,8 нг VACC ТОПО производится не обнаруживается сигнал.
  3. Т4 ДНК-лигазы 5 ед / мкл (Roche). Это высококонцентрированный лигазы подготовка дает лучший сигнал в наших экспериментальных условиях.
  4. 10 х реакционный буфер для T4 ДНК-лигазы: 660 мМ Трис-HCl, 50 мМ MgCl 2, 10 мМ dithioerythritol, 10 мМ АТФ, рН 7,5 (20 ° C) (Roche). АТФ в реакционном буфере, легко разрушается в повторяющихся циклов оттаивания-замерзания. Алиготе буфера в небольших 15-20 мкл порции и храните при температуре - 20 ° C. Использование один раз.
  5. 30% (вес / объем) раствора ПЭГ-8000 (Sigma) в бидистиллированной воде. 15% ПЭГ-8000 в реакционную смесь сильно стимулирует выявление, увеличение эффективной концентрации его составляющие по объему исключения.
  6. Протеиназы К (Roche) 20 мг / мл маточного раствора в дистиллированной воде. Хранить при температуре - 20 ° С. В реакции использовать 50мг/мл решение в PBS, приготовленные из запаса. Не используйте повторно.
  7. Vectashield с DAPI (Vector Laboratories).
  8. Бикарбонат натрия буфера: 50 М NaHCO 3, 15м М NaCl, рН 8,2.
  9. 22x22mm или 22x40mm стекла или пластика покровных. Пластиковые покровные предпочтительнее в ходе реакции, так как ониповторно легче удалить из раздела.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
  4. Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
  5. McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
  6. Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
  7. Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
  8. Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
  9. Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
  10. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
  11. Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
  12. Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
  13. Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
  14. Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
  15. Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
  16. Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

K4

Похожие статьи