MAME Модели 4D Онлайн-клеточного изображения опухоли: микроокружение взаимодействия, что воздействие злокачественной прогрессии

Краткое содержание

Мы разработали 3D-моделей coculture для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между опухолевых клетках молочной железы и других клеток в их микросреды, влияющих на прогрессирование инвазивного фенотипа. Эти модели могут служить в качестве экранов для доклинических наркотиков целевой паракринной вызванных протеолитических, хемокинов / цитокинов и киназы пути причастных к инвазии.

Аннотация

Мы разработали модели 3D-сокультивирования, которые мы назвали MAME (mammary architecture and microenvironment engineering — инженерия архитектуры и микроокружения молочной железы), и использовали их для визуализации взаимодействий между клетками в режиме реального времени. Нашей общей целью было создание моделей, воспроизводящих архитектуру преинвазивных поражений молочной железы, для изучения их прогрессирования в инвазивный фенотип. В частности, мы разработали модели для анализа взаимодействий между вариантами предраковых эпителиальных клеток молочной железы и другими типами клеток опухолевого микроокружения, которые, как полагают, способствуют или препятствуют переходу преинвазивных эпителиальных клеток молочной железы в инвазивную протоковую карциному. Среди других типов клеток, изученных к настоящему времени, — миоэпителиальные клетки, фибробласты, макрофаги, а также эндотелиальные клетки кровеносных и лимфатических микрососудов. В дополнение к моделям MAME, предназначенным для воспроизведения клеточных взаимодействий в молочной железе при прогрессировании рака, мы разработали аналогичные модели для изучения прогрессирования рака предстательной железы.

В данном видео мы демонстрируем процедуры создания 3D-сокультивируемых систем, а также использование визуализации живых клеток и функционального анализа протеолиза для отслеживания перехода сокультур клеток протоковой карциномы молочной железы in situ (DCIS) и фибробластов к инвазивному фенотипу с течением времени, в данном случае — на протяжении двадцати трех дней культивирования. Сокультуры MAME состоят из нескольких слоев. Фибробласты иммобилизованы в нижнем слое коллагена I типа. Сверху наносится слой реконструированного базального мембранного матрикса (rBM), на который высевают клетки DCIS. Заключительный верхний слой 2% rBM добавляется и обновляется при каждой смене среды. Для визуализации протеолиза, связанного с прогрессированием к инвазивному фенотипу, мы используем флуоресцентные матриксные белки с гашенным свечением (DQ) (DQ-коллаген I смешивают с слоем коллагена I, а DQ-коллаген IV — со средним слоем rBM) и наблюдаем за живыми культурами с помощью конфокальной микроскопии. Оптические срезы захватываются, обрабатываются и реконструируются в 3D с помощью программного обеспечения для визуализации Volocity. В течение 23 дней в сокультурах MAME клетки DCIS пролиферируют и сливаются в крупные инвазивные структуры. Фибробласты мигрируют и включаются в эти инвазивные структуры. Флуоресцентные протеолитические фрагменты коллагенов обнаруживаются на поверхности структур DCIS, внутри клеток, а также распределены по всему окружающему матриксу. Препараты, воздействующие на протеолитические, хемокиновые/цитокиновые и киназные пути, или изменения в клеточном составе сокультур могут снижать инвазивность, что свидетельствует о возможности использования моделей MAME в качестве доклинического скрининга новых терапевтических подходов.

Протокол

1. Подготовить DQ-подложки

1. Позвольте лиофилизированный DQ-подложки нагревали до комнатной температуры перед открытием флаконов, готовят маточный раствор 1 мг / мл DQ-подложки в деионизованной воды, разделить на 50 мкл аликвоты и хранят при температуре 4 ° C.

Это может быть необходимо, чтобы агитировать DQ-подложки в ультразвуковой ванне воды ~ 5 мин и тепла до 50 ° C для облегчения дисперсии.

2. Оттепель УКР на льду в течение ночи при 4 ° С; УКР должны решаться на льду во все времена.
3. Для того, чтобы 10 раз фосфатным буферным раствором (PBS), растворите 80 г NaCl (1,37 м), 2 г хлорида калия (0,027 М), 14,4 г Na ₂ HPO ₄ (1 м), и 2,4 г KH ₂ PO ₄ (0,02 М) в 800 мл воды высокой степени очистки. Отрегулируйте рН буферного раствора PBS до 7,4 с 1,0 М HCl. Довести объем до 1 литра, стерилизуют путем фильтрации.
4. Подготовить коллагена I решения на льду: 8 частей охлажденной коллагена I и 1 часть охлажденного 10х PBS. Отрегулируйте рНсмеси на 7,2-7,6 стерильные 0,1 М NaOH. Проверьте рН с рН полосы и установить окончательный объем до 10 частей стерильной водой.
5. Подготовить DQ-коллаген I: коллаген I матрицы путем разбавления DQ-коллаген I коллагена I решения в prechilled трубы до конечной концентрации 25 мкг / мл и 2,4 мг / мл, соответственно.
6. Подготовить DQ-коллагена IV: восстановленный базальной мембраны (УКР) матрицы путем разбавления DQ-коллагена IV в УОР (Cultrex или Матригель) в prechilled трубы до конечной концентрации 25 мкг / мл и 12-15 мг / мл, соответственно. Смешать на льду с нежным пипетирования, чтобы избежать создания пузырей.

2. Подготовить MAME cocultures

См. Рисунок 1 Схема cocultures.

1. Поместите два прямоугольных пластиковых покровные (стерилизуют в 70% спирте в течение 10 мин и сушат на воздухе) в 35-мм культуры блюдо или использовать IbiTreat 35-мм μ-блюдо. Проезд здесь для покровных и μ-блюда, которые мы используем для студентовумирает на прямой микроскоп. Для исследования на инвертированный микроскоп, мы используем только μ-блюда.
2. Смешайте необходимое количество фибробластов с DQ-коллаген I: коллаген I матрицы. Для долгосрочных cocultures показано на рисунках 2 и 3, мы используем 500 фибробластов в 10 мкл среды плюс 60 мкл DQ-коллаген I: коллаген I матрицы.
3. Использование 100-мкл micropipettor, тщательно пипетки и распространение 70 мкл фибробластов: DQ-коллаген I: коллаген I матрицы по всей поверхности каждого покровного и оставить на 37 ° C в увлажненном инкубаторе без CO ₂ в течение 30 минут, чтобы затвердеть.
4. Передача 35-мм блюд, содержащих покровные до 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 10 минут, чтобы уравновесить.
5. Удалить из инкубатора и оставить 35-мм блюда под капотом, пока они не до комнатной температуры.
6. Добавить 60 мкл DQ-коллагена IV: УКР матрица на вершине укрепили DQ-я коллагена: коллаген I матрица со встроенными фибробластов. С пипетки, околоrefully распространяться DQ-коллагена IV: УКР матрицы равномерно, избегая царапин фибробластов: DQ-я коллагена: коллаген I матрицы.
7. Передача 35-мм блюд, содержащих покровные до 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 10 минут, чтобы затвердеть. В то время как DQ-коллагена IV: УКР матрицы твердеть, trypsinize и рассчитывать эпителиальных клеток.
8. Место 50 мкл эпителиальных / опухолевых клеток на покровных подвески покрыты DQ-коллагена IV: УКР матрицы. Место 35-мм блюд, содержащих покровные в 37 ° C инкубатора. Позвольте от 40 до 60 минут клетки прикрепляются к DQ-коллагена IV: УКР матрицы. Для долгосрочных cocultures показано на рисунках 2 и 3, мы используем 2500 эпителиальных или опухолевые клетки.
9. Добавить 2 мл культуральной среде, содержащей 2% УКР каждого 35-мм блюдо. Если делать любой лекарственной терапии, лекарства должны быть добавлены в это время.
10. Инкубировать требуемый период времени, прежде чем изображения. За многолетнюю культуру, средства массовой информации следует менять каждые 3-4 дней. Клетки могут быть сохраненыв нормальном культуральной среде. Для MAME cocultures линии груди клетки, мы используем эпителиальных базальных Средний (MEBM-PRF) с добавлением SingleQuots MEGM.

3. Выполните 4D (3D + время) изображения живых MAME cocultures по конфокальной микроскопии

1. Для доказательства правового принципа исследования показано, MAME cocultures были помечены флуоресцентным красителем отслеживания ячейки в соответствии с нашей процедурой опубликован ^1. После промывки PBS, cocultures инкубировали с 5 мкМ CellTracker оранжевой средней MEGM в течение 45 мин при 37 ° C инкубатора, промывают снова PBS и инкубировали с нагретого MEGMmedium в течение 30 минут в 37 ° C с 5% CO ₂ инкубаторе до изображения .
2. Изображение MAME cocultures жить в малом увеличении (10х, вода погружения линз) на Zeiss LSM-510 META конфокальной микроскопии.
3. Оптический разделы захватили с интервалами на всю глубину структур. Для нашего исследования, мы фиксируем оптических срезов в 10мкм интервалами.
4. Использование оптических разделы для восстановления изображений в 3D. Мы используем Volocity программное обеспечение для создания 3D-реконструкции.
5. Сделать фильмы 3D реконструкции, так что структуры, клетки: клетка взаимодействия и взаимодействия с окружающими матрицы могут быть визуализированы. Мы сделали фильмы с QuikTime Player 7.

4. Представитель Результаты

MAME cocultures, который мы разработали являются послушными экспериментальная модель для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между различными сотовой избирателей, что составляет опухоли молочной железы и его микросреды. Здесь мы показываем возможности модели MAME резюмировать клетки: клетка взаимодействия во время кормления прогрессии рака и живых клеток изображений следовать этим взаимодействием с течением времени. Проиллюстрируем возможности изображения взаимодействия между преинвазивных MCF10.DCIS линии человеческих клеток рака молочной железы и рака молочной железы человека связанного линии фибробластов, WS-12ти болеев течение более трех недель в культуре. Cocultures были обследованы на 3, 16 и 23 дней. Оптический разделов через весь объем cocultures были реконструированы в 3D и характерные примеры приведены для каждого из трех моменты времени на рисунке 2. Красной флуоресценции на рисунке 2 представляет MCF10.DCIS и WS-12ти клеток. Чтобы различать два типа клеток и для долгосрочного cocultures можно трансфекции или трансдукции отдельных типов клеток с флуоресцентными белками до создания культуры. Coculture MAME из MCF10.DCIS и WS-12ти клеток, которые дифференциально помечены флуоресцентных белков для идентификации показано на рисунке 3.

Объединив субстратов, в этом случае DQ-коллагенов, в MAME cocultures, мы можем оценить и количественно меняется во времени в протеолиза связанные с переходом к инвазивным фенотипом. Мы создали методы количественной флуоресцентной продуктов расщепления, которые приводят кот DQ-деградации коллагена ^2,3. Мы нормализации продукты распада по всей 3D-объем MAME cocultures в расчете на клетку маркировки и подсчета клеточных ядер. Кроме того, мы можем локализовать деградации внеклеточного и внутриклеточного отсеков и количественной оценки общего, внутри-и внеклеточных продуктов распада, как мы описали выше ^2. Зеленая флуоресценция на рисунках 2 и 3 представлены продукты расщепления двух DQ-коллагеновых субстратов. В это время, дифференциально-меченных коллагена не доступны, которые позволили бы нам провести различие между деградации коллагена IV типа и деградации коллагена типа I.

Взаимодействия в MAME cocultures динамичны и могут меняться с течением времени. Для получения временной и динамической информации, то же самое поле зрения может в образ и оптических срезов, сделанные через весь образец объема неоднократно в течение периода времени от нескольких минут до нескольких недель,Таким образом сбор данных в 4-D. На рисунке 2 мы показываем довольно драматические изменения, которые происходят в течение 23 дней: изменение числа клеток, миграцию клеток и клеточных взаимодействий, структура объемы, структура формы, отклонения структуры от сферичности, инвазивные наросты и протеолиза. Кроме того, мы продемонстрировали общее изменение объема в связи с MAME cocultures унижающее достоинство окружающих их внеклеточного матрикса в течение этого периода времени. На три дня, как показано на рисунке 2А, объемом 110 000 мкм ^3. С другой стороны, объем MAME cocultures на 16 и 23 дней только 46 250 мкм ^3, как показано на рисунках 2В и C.

Рисунок 1. Схема MAME cocultures. Пластиковые покровное покрыта коллагена I, содержащие коллаген DQ-я и фибробластов (пурпурный). 2-й слой восстановленного базальной мембраны (УОР), содержащий DQ-колЛаген IV добавляется. Опухолевые клетки (красный) высевают на вершине, и 2% УКР в культуральной среде накладывается (белые точки) при каждом изменении информации. Зеленый флуоресцентный представляет продукты расщепления DQ-коллаген I и IV.

Рисунок 2. MAME cocultures из MCF10.DCIS человеческих клеток рака молочной железы и WS-12ти фибробластов человека груди. Фибробласты были внедрены в коллаген I / DQ-коллаген я и выложил с УКР содержащие DQ-коллагена IV. DCIS Затем клетки высевают на ОРУ и выложил в средах, содержащих 2% УКР. За 23 дней в coculture показано здесь, было пролиферации клеток, деградации DQ-коллагена IV и I (зеленый) и коллагена матрицы, как показано на сокращение объема cocultures. Клетки были локализованы на маркировке с оранжевой CellTracker на месте до изображения (красного цвета). То же самое живое cocultures наблюдались в течение 23 дней с изображений, сonfocal микроскопии на 3, 16 и 23 дней coculture. В результате оптический кусочки были реконструированы в 3D с Volocity программного обеспечения. Увеличение, 10Х.

Рисунок 3. MAME 16 дней cocultures из MCF10.DCIS человеческих клеток рака молочной железы и WS-12ти фибробластов человека груди, которые выражают RFP (красный) и YFP (белый), соответственно. Cocultures были созданы и проанализированы как показано на рисунке 2. Эти два типа клеток показано здесь был, однако, были обозначены, поэтому дифференциально чтобы их можно было отличить друг от друга. Чем больше увеличение изображения в этой фигуре, по сравнению с тем, на рисунке 2, показывают, протеолиз DQ-коллагена IV на поверхности клеток DCIS и диффузных протеолиза коллагена DQ-я в районах вблизи фибробластов. Увеличение, 20X.

Обсуждение

Как показано, MAME cocultures может быть использован для живых клеток изображений в режиме реального времени взаимодействия между различными сотовой избирателей, что составляет опухоли молочной железы и его микросреды. В текущие исследования в нашей лаборатории, мы использовали MAME cocultures определить протеолитические пути связано с переходом от DCIS к инвазивным раком протоков, а также взаимодействия между протеолитическими путей и других путей, участвующих в этом переходе, таких как хемокинов / цитокинов / рост пут...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент / Оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Восстановленный базальной мембраны (Cultrex)	Trevigen	3445-005-01	Сопоставимые с Матригель (BD Biosciences)
Коллаген я	Сплоченность лаборатории	5005-B
DQ-подложки (Коллаген I, IV)	Invitrogen	DQ-кол I-D12060 DQ-кол IV D12052
22-мм пластиковыми покровные	Компания Fisher Scientific	12-547	Разрежьте пополам, оставит в 70% этаноле в течение 10 мин и воздушно-сухой перед использованием.
Среду клеточной культуры	Lonza	MEBM CC-PRF-3153 MEGM CC-4136	Фенол красный бесплатно
ibiTreat μ-Блюдо	Ibidi	80136
Volocity программного обеспечения	Перкин-Элмер	Версия 5.5	Другие бренды изображений программное обеспечение может быть использован для создания 3D-реконструкции и фильмов.