Методическая статья

Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице

25.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3691

⸱

23 марта 2012 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience & Pharmacology, Rudolf Magnus Institute for Neuroscience, University Medical Center Utrecht

В этой статье

Краткое содержание

Эксплантов из системы мозга дофамина и стриатуме используются в анализе коллагеновой матрицы для В пробирке Анализ mesostriatal и striatonigral путь развития. В данном анализе аксонального результат и рекомендации можно манипулировать и количественно. Она также может быть модифицирован для оценки других регионов или молекулярных сигналов.

Аннотация

Мозге дофамина (mdDA) нейронов проект по медиальной пучка переднего мозга на несколько областей, в конечном мозге, в том числе стриатуме 1. Взаимно, средних колючих нейронов в полосатом теле, которые приводят к striatonigral (прямой) путь иннервируют черной субстанции 2. Развитие этих аксонов путей зависит от комбинаторного действия множества роста аксонов и руководство в том числе сигналы молекул, которые выпущены невриты или (промежуточные) целевые регионы 3,4. Эти растворимые факторы могут быть изучены в лабораторных на mdDA культивирования и / или полосатой эксплантов в коллагеновой матрицы, которая обеспечивает трехмерную подложку для аксонов имитируя внеклеточной среде. Кроме того, коллагеновые матрицы позволяет формирование относительно стабильного градиенты белков выпущен других эксплантов или клетки помещаются в непосредственной близости (см., например, ссылки 5 и 6). Здесь мы опишем методы PURкации крысы хвост коллагена, микродиссекции дофаминергической и полосатой эксплантов, их культуры в коллаген гели и последующего иммуногистохимического и количественного анализа. Во-первых, мозг эмбриона мыши E14.5 изолированы и дофаминергической и полосатой эксплантов которые микродиссекции. Эти эксплантов затем (со) культивировали в коллагеновых гелей на покровные 48 до 72 часов в лабораторных условиях. Впоследствии аксонального проекции визуализируется использованием нейронных маркеров (например, тирозин гидроксилазы, DARPP32 или βIII тубулина) и рост аксонов и притяжения или отталкивания ответы аксона количественно. Это нейронов подготовки является полезным инструментом для лабораторного исследования клеточных и молекулярных механизмов mesostriatal и striatonigral рост аксонов и руководства в процессе разработки. С помощью этого анализа, можно также оценить другие (промежуточные) цели дофаминергической и полосатой аксонов или для проверки специфических молекулярных сигналов.

Протокол

1. Подготовка крысы хвост Коллаген

  1. Соберите 6-10 взрослых крыс хвосты (это можно хранить хвосты при -20 ° C до использования).
  2. Замочите хвосты в 95% этаноле в течение ночи при комнатной температуре (RT).

Препарирование крысиные хвосты (в ткани капот культура):
(Держать инструменты в 70% этанола, если не используете их и убедиться, что все решения, инструменты и изделия, используемые в этой процедуре являются стерильными)

  1. Для сбора сухожилия с хвостами, отрезать кончик хвоста. Держите большой конце хвоста с парой щипцов. Используйте другую пару щипцов держать, согнуть и слом....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Анализ коллагеновой матрицы, описанные здесь были использованы и улучшены различные лаборатории в последние десятилетия, чтобы исследовать различные аксона руководством молекул и нейронных систем (например, см. ссылки 5-8). Эти исследования показали, что этот анализ является мощным инструментом для изучения воздействия и регулирования аксона руководством молекул выделяется различными (промежуточный) тканях.

Тем не менее, следует отметить, что коллагеновой матрицы является заменой внеклеточно.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Анализ коллагеновой матрицы была разработана и улучшена работа различных исследовательских групп в течение последних двух-трех десятилетий. Подходов, описанных здесь, дофаминергических и полосатой эксплантов большую пользу от этих исследований. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Asheeta Прасад за помощь в создании полосатого культурами эксплантов. Работа в лаборатории была профинансирована по правам границы Научная программа организации (премия развития карьеры), Нидерландская организация по научным исследованиям и развитию (ZonMw-VIDI и ZonMw-TOP), Europanian союза (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , грант 222 999) (для RJP) и Нидерландская организация по научны....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Эмбриональной телячьей сыворотки BioWhittaker 14-801F
Глютамин (200 мм) ПАА M11-004
Hepes VWR International 441476L
β-меркаптоэтанол Merck 444203
Минимальные основные медиа (MEM) Гибко 61100-087
Neurobasal Гибко 21103-049
B27 Гибко 17504-044
L-15 Лейбовиц в средней Гибко 11415-049
Пенициллин, стрептомицин Гибко 15070-063
Продлить Золото реагентов Antifade Invitrogen P36930
Диализ трубы Spectrum Labs 132660
Кролик против тирозингидроксилазы Pel-Freez P40101-0
Кролик против Darpp32 (Н-62) Санта-Крус Sc-11365
Мышь против βIII тубулина Сигма T8660
Alexa Fluor меченых вторичных антител Invitrogen

Ссылки

  1. van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
  2. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobi....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи