Методическая статья

В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa

18.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3702

⸱

26 марта 2012 г.

 , 
1RNA Biology, New England Biolabs

В этой статье

Краткое содержание

В данном методе описывается высокоэффективный синтез in vitro как кэпированной, так и некэпированной мРНК из линеаризованной плазмиды, содержащей ген люциферазы Gaussia (GLuc). РНК подвергается очистке, после чего часть некэпированной РНК кэпируется ферментативно с использованием кэпирующего фермента вируса Vaccinia. На заключительном этапе мРНК трансфецируют в клетки HeLa, после чего супернатанты клеточных культур анализируют на люциферазную активность.

Аннотация

In vitro транскрипция представляет собой синтез РНК-транскриптов РНК-полимеразой на основе линейной матрицы ДНК, содержащей соответствующую последовательность промотора (T7, T3, SP6) и ген, который необходимо транскрибировать (Рисунок 1A). Типичная реакция транскрипции включает матричную ДНК, РНК-полимеразу, рибонуклеотидтрифосфаты, ингибитор РНКазы и буфер, содержащий ионы Mg2+.

Для многих областей применения часто требуются большие количества высококачественной РНК. Использование транскрипции in vitro описывалось в исследованиях структуры и функций РНК, таких как сплайсинг1, эксперименты по РНК-интерференции в клетках млекопитающих2, амплификация антисмысловой РНК методом Эбервайна («Eberwine method»)3, микрочиповый анализ4, а также в исследованиях РНК-вакцин5. Этот метод также может быть использован для получения радиоактивно и флуоресцентно меченных зондов6. Уоррен и др. недавно сообщили о перепрограммировании человеческих клеток путем трансфекции кэпированной РНК, транскрибированной in vitro7. Набор T7 High Yield RNA Synthesis Kit от New England Biolabs разработан для синтеза до 180 μg РНК в реакции объемом 20 μl. С помощью данного набора была успешно осуществлена транскрипция РНК длиной до 10kb. В качестве матриц для транскрипции могут быть использованы линеаризированная плазмидная ДНК, продукты ПЦР и синтетические ДНК-олигонуклеотиды, при условии наличия последовательности промотора T7 выше по течению от транскрибируемого гена.

Добавление структуры 5'-концевого кэпа в РНК является важным процессом у эукариот. Это необходимо для стабильности РНК8, эффективной трансляции9, ядерного транспорта10 и сплайсинга11. Процесс включает добавление 7-метилгуанозинового кэпа к 5'-трифосфатному концу РНК. Кэпирование РНК может быть осуществлено посттранскрипционно с помощью ферментов кэпирования или котранскрипционно с использованием аналогов кэпа. При ферментативном методе мРНК кэпируется с помощью фермента кэпирования вируса Vaccinia12,13. Фермент добавляет 7-метилгуанозиновый кэп к 5'-концу РНК, используя GTP и S-аденозилметионин в качестве доноров (структура cap 0). Оба метода позволяют получить функционально активную кэпированную РНК, подходящую для трансфекции или других приложений14, таких как создание вирусной геномной РНК для систем обратной генетики15 и кристаллографические исследования кэп-связывающих белков, таких как eIF4E16.

В методе, описанном ниже, используется набор T7 High Yield RNA Synthesis Kit от NEB для синтеза кэпированных и некэпированных РНК-транскриптов люциферазы Gaussia (GLuc) и люциферазы Cypridina (CLuc). Часть некэпированной РНК GLuc кэпируется с помощью системы Vaccinia Capping System (NEB). В качестве матрицы ДНК используется линеаризованная плазмида, содержащая ген GLuc или CLuc и T7-промотор. Транскрибированная РНК трансфицируется в клетки HeLa, после чего супернатанты клеточных культур анализируются на люциферазную активность. Кэпированная РНК CLuc используется в качестве внутреннего контроля для нормализации экспрессии GLuc.

Протокол

РНКазы обычно присутствуют на коже, волосах, в пыли, на лабораторных поверхностях, в растворах и т. д. Во избежание контаминации РНКазами используйте перчатки и тщательно очищайте рабочую поверхность стола, пипетки и т. д. перед использованием. Настоятельно рекомендуется использовать безнуклеазные наконечники для пипеток, пробирки, стеклянную посуду и реагенты.

1. Транскрипция in vitro с использованием набора T7 High-yield RNA Synthesis Kit

В качестве матрицы ДНК для реакции транскрипции используется линеаризованная плазмида, содержащая ген люциферазы Gaussia и промотор T7 выше кодирующей последовательности (Рисунок 1B).

  1. Разморозьте компоненты набора T7 High Yield RNA Synthesis kit и держите их на льду.
  2. Для синтеза некэпилированного РНК подготовьте реакционную смесь при комнатной температуре в следующем порядке:
КомпонентОбъем (μl)Конечная концентрация
Вода, свободная от нуклеаз*X 
10X реакционный буфер21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (100 mM)210mM
Матричная ДНК *X1 μg
Смесь с РНК-полимеразой T72 
Итого20 

*Добавьте 1 μg ДНК и доведите общий объем реакции до 20 μl водой, не содержащей нуклеаз. Количество добавляемой воды будет зависеть от концентрации матричной ДНК.

  1. Для кэпированной РНК: подготовьте реакционную смесь при комнатной температуре в следующем порядке:
КомпонентОбъем (μl)Конечная концентрация
Вода, свободная от нуклеаз*X 
10X реакционный буфер21X
ATP (100 mM)210mM
CTP (100 mM)210mM
UTP (100 mM)210mM
GTP (20 mM)22mM
Аналог кэпа 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA) (40mM)48mM
Матричная ДНК*X1 μg
Смесь с РНК-полимеразой T72 
Итого20 

*Добавьте 1 μg ДНК и доведите общий объем реакции до 20 μl водой, свободной от нуклеаз. Количество добавляемой воды будет зависеть от концентрации матричной ДНК.

  1. Тщательно перемешайте смесь с помощью вортекса и инкубируйте реакции при 37 °C в течение 2 часов в суховоздушном инкубаторе.
  2. Следуя шагам 1.3-1.4, синтезируйте кэпированные транскрипты люциферазы Cypridina (CLuc) из линеаризованной плазмиды, содержащей ген CLuc. Эта мРНК будет ко-трансфицирована вместе с кэпированной и некэпированной мРНК GLuc для нормализации экспрессии GLuc.

2. Удаление матричной ДНК

Реакционные смеси после транскрипции обрабатывают DNase I для удаления матрицы ДНК перед переходом к очистке.

  1. Добавьте 70 μl воды, свободной от нуклеаз, в смеси для транскрипции, а затем 10 μl реакционного буфера для DNase I.
  2. Добавьте в реакционные смеси 2 μl DNase I.
  3. Инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут в сухом воздушном инкубаторе.

3. Колоночная очистка кэпированной и некэпированной РНК

  1. Очистите кэпированную и некэпированную РНК с помощью набора MEGAclearKit согласно инструкциям производителя (можно использовать любой набор для очистки РНК на основе центрифужных колонок).
  2. Определите количество РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop.
  3. Оцените качество образцов РНК с помощью набора Agilent RNA 6000 Nano Kit и биоанализатора Agilent 2100 в соответствии с инструкциями производителя.

4. Кэпирование РНК с использованием системы кэпирования Vaccinia

  1. Возьмите 10 μg очищенной некэпированной мРНК GLuc.

Стандартная реакция кэпирования позволяет кэпировать до 10 μg РНК (длиной 100nt или более). Если требуется кэпировать большее количество РНК, масштаб реакции можно увеличить соответствующим образом.

  1. Доведите объем до 15 μl, используя воду, свободную от нуклеаз.
  2. Нагрейте РНК при 65 °C в течение 10 минут для устранения вторичных структур. Поместите на лед на 5 минут.
  3. Для проведения реакции кэпирования к 15 μl денатурированной РНК добавьте 2 μl 10X буфера для кэпирования (Capping Buffer), 1 μl GTP (10 mM), 1 μl свежеразведенного S-аденозилметионина (2 mM) и 1 μl (10 единиц) кэпирующего фермента Vaccinia.
  4. Тщательно перемешайте смесь, осторожно провзболтав на вортексе, и инкубируйте реакцию при 37 °C в течение 30 минут в сухом воздушном инкубаторе.

5. Колоночная очистка кэпированной РНК

  1. Очистите кэпированную РНК с помощью набора MEGAclear Kit (можно использовать любой набор для очистки РНК на основе спин-колонок).
  2. В соответствии с инструкциями производителя оцените качество образцов РНК, используя набор Agilent RNA 6000 Nano Kit и биоанализатор Agilent 2100 Bioanalyzer.

6. Трансфекция клеток HeLa с использованием набора для трансфекции мРНК TransIT

  1. Высейте клетки HeLa в 48-луночный планшет в 150 μl модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (0,7-2,3 × 105 клеток на лунку).
  2. Инкубируйте в течение 16-24 часов при 37 °C до достижения клетками 60-90% конфлюэнтности.
  3. Разведите РНК GLuc (с кэпом и без кэпа) и CLuc до концентрации 100 ng/μl.

Каждую трансфекцию проводят в 8 повторностях.

  1. Подготовьте 8 пробирок Eppendorf пробирки. В каждую пробирку добавьте 1 μl некэпированная РНК GLuc, 1 μl кэпированная РНК CLuc (для нормализации) и 25 μl безсывороточной среды DMEM. Тщательно перемешайте.
  2. Подготовьте 8 пробирок Eppendorf. В каждую пробирку добавьте 1 μl кэпированная РНК GLuc (кэп-аналог), 1 μl кэпированная мРНК CLuc (для нормализации) и 25 μl бессывороточной среды DMEM. Тщательно перемешайте.
  3. Подготовьте 8 пробирок Eppendorf. В каждую пробирку добавьте 1 μl кэпированная РНК GLuc (Вакцина), 1 μl кэпированная РНК CLuc (для нормализации) и 25 μl безсывороточной среды DMEM. Тщательно перемешать.
  4. Добавить 0.2 μl Добавьте реагент mRNA Boost в первую группу из 8 пробирок и перемешайте.
  5. Добавить 0.2 μl ПереводДобавьте реагент мРНК в первую группу из 8 пробирок и перемешайте.
  6. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2–5 минут. (Не инкубируйте более 5 минут).
  7. Покапельно добавьте смесь для трансфекции в лунки с культурами клеток HeLa (см. Рисунок 3 (для подготовки планшета).
  8. Повторите шаги с 7 по 10 для образца 2не определено и 3р-д наборы по 8 пробирок.
  9. Инкубируйте в течение ночи (16 часов) при 37 °C в 5% CO2.

7. Анализ с использованием люциферазы Gaussia (GLuc)

Определите активность GLuc в супернатанте из каждой лунки, используя набор BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit следующим образом:

  1. Приготовьте свежий рабочий раствор для анализа, добавив 15 μl субстрата BioLux GLuc к 1.5 ml буфера для анализа BioLux GLuc (на один образец требуется 50 μl рабочего раствора). Приготовьте объем, достаточный для всех образцов и для заполнения инжектора люминометра (см. инструкции производителя).
  2. Тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку (не используйте вортекс).

Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного люминометра Centro LB 960 от Berthold Technologies.

  1. Установите на люминометре объем инъекции 50 μl и время интегрирования от 2 до 10 секунд.
  2. Перенесите по 10 μl супернатанта клеточной культуры из каждой лунки в черный 96-луночный планшет.
  3. Заполните инжектор рабочим раствором для анализа и приступите к измерению люминесценции.
  4. Значения, полученные из нетрансфицированных лунок, будут использоваться в качестве отрицательного контроля.

8. Анализ с использованием люциферазы Cypridina (CLuc)

Проведите анализ супернатанта из каждой лунки на активность CLuc, используя набор для анализа люциферазы Cypridina BioLux Luciferase Assay Kit, следующим образом:

  1. Приготовьте свежий реконструированный субстрат (100x) в соответствии с инструкциями, приведенными в руководстве к набору.
  2. Разморозьте буфер для анализа BioLux Cypridina Luciferase и тщательно перемешайте (беречь от света).
  3. Для приготовления раствора для анализа CLuc добавьте 15 μl реконструированного субстрата (100x) к 1,5 ml буфера для анализа BioLux Cypridina Luciferase (на один образец требуется 50 μl раствора для анализа). Приготовьте объем, достаточный для всех образцов и для промывки инжектора люминометра (см. инструкции производителя).
  4. Тщательно перемешайте, несколько раз перевернув пробирку (не использовать вортекс).
  5. Выдержите раствор при комнатной температуре в течение 30 минут (беречь от света).

Люминесценцию измеряли с помощью микропланшетного люминометра Centro LB 960 от компании Berthold Technologies.

  1. Настройте люминометр на инъекцию 50 μl, задержку 1-2 секунды и время интегрирования 2-10 секунд.
  2. Перенесите по 10 μl супернатанта клеточной культуры из каждой лунки в черный 96-луночный планшет.
  3. Заполните инжектор раствором для анализа CLuc и измерьте люминесценцию.
  4. Значения, полученные из нетрансфицированных лунок, будут использованы в качестве отрицательного контроля.

9. Репрезентативные результаты

Набор T7 High Yield RNA Synthesis Kit позволяет синтезировать до 180 μg некэпированной РНК и от 40 до 50 μg кэпированной РНК в одной реакции объемом 20 μl. При анализе на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer высококачественная интактная РНК должна проявляться в виде одного острого пика, соответствующего транскрипту РНК. Широкий пик или наличие нескольких пиков свидетельствуют о деградации РНК. Также важно проверить размер РНК. Появление транскриптов РНК большей длины, чем ожидалось, может быть следствием неполного переваривания матричной плазмидной ДНК. Деградация РНК и снижение выхода продукта обычно являются результатом попадания примесей в реакционную смесь из матрицы ДНК. На рисунке 2 представлен пример электроферограммы и изображения геля, полученных при анализе высококачественной интактной РНК на биоанализаторе.

После трансфекции клеток HeLa РНК GLuc как с кэпом, так и без него, следует инкубация и анализ супернатантов клеточных культур на люциферазную активность. Структура 5'-кэпа важна для защиты РНК от экзонуклеазной деградации8 и для стимуляции инициации трансляции9 мРНК. Таким образом, кэпирование РНК является важным этапом экспериментов по трансфекции. Метод котранскрипционного кэпирования (с использованием аналога кэпа) позволяет получить примерно 40 μg РНК с уровнем кэпирования 80%. Протокол с использованием кэпирующего фермента Vaccinia обеспечивает кэпирование до 10 μg РНК (длиной 100 nt и более) за одну реакцию с эффективностью почти 100%.

Рисунок 4 демонстрирует различие в экспрессии люциферазы между культурами, трансфицированными образцами кэпированной и некэпированной РНК. Отчетливо видно, что клеточные культуры, трансфицированные кэпированной РНК, демонстрируют гораздо более высокую экспрессию люциферазы по сравнению с культурами, трансфицированными некэпированной РНК (в которых активность люциферазы отсутствует). Кроме того, Рисунок 4 подтверждает, что оба метода кэпирования — с использованием аналога кэпа и с использованием кэпирующего фермента Vaccinia — успешно позволяют получить функциональные кэпированные транскрипты РНК, которые могут транслироваться в белок. Двустороннее значение p, полученное в результате t-критерия, составило 0,2583, что указывает на отсутствие статистически значимого различия между данными о люминесценции для двух методов кэпирования.

Схема T7-транскрипции; матрица ДНК, РНК-транскрипт; процесс нуклеотидной последовательности.

Рисунок 1A. Синтез РНК Т7-РНК-полимеразой

Схема плазмиды pCMV-GLuc, 5764 bp; экспрессия генов, клонирующие векторы, сайты рестрикции.
Рисунок 1B. Вектор pCMV-GLuc, содержащий ген GLuc и промотор T7.

Результаты хроматографии РНК; анализ некэпированной и кэпированной РНК; электрофореграмма.
Рисунок 2. Электрофореграммы Bioanalyzer и гель-образное изображение кэпированной и некэпированной РНК. Ось X — размер РНК в нуклеотидах (nt), ось Y — единицы флуоресценции (FU). A) Электрофореграмма мРНК GLuc (некэпированной) после очистки. B) Электрофореграмма мРНК GLuc (кэпированной с помощью кэпирующего фермента Vaccinia). C) Электрофореграмма мРНК GLuc (кэпированной ко-транскрипционно с использованием аналога кэпа). D) Гель-образное изображение, созданное системой Bioanalyzer. Дорожка «L» — маркер РНК, дорожка 1 — некэпированная мРНК GLuc, дорожка 2 — мРНК GLuc, кэпированная с помощью аналога кэпа, и дорожка 3 — РНК GLuc, кэпированная с помощью кэпирующего фермента Vaccinia.

Схема расположения лунок для эксперимента по экспрессии генов; типы образцов: некэпированные/кэпированные GLuc и CLuc.
Рисунок 3. Пример подготовки планшета для трансфекции клеток HeLa. В каждой лунке находятся высеянные клетки HeLa с конфлюэнтностью 60-90%. В каждую лунку добавляют смесь для трансфекции, состоящую из соответствующей РНК GLuc (некэпированной, кэпированной с помощью аналога кэпа или кэпированной с помощью кэпирующего фермента Vaccinia), кэпированной РНК CLuc (для нормализации), реагента mRNA Boost и реагента TransIT mRNA. Каждая трансфекция проводится в 8 повторах (лунки одного цвета на рисунке).

Столбчатая диаграмма нормализованной люминесценции; кэпированная и некэпированная РНК GLuc; результаты анализа РНК.
Рисунок 4.Экспрессия GLuc в клетках HeLa. Очищенная кэпированная и некэпированная мРНК GLuc была трансфицирована в клетки HeLa и инкубирована в течение ночи (16 ч) при 37 °C. В супернатантах клеточных культур из каждой лунки определяли активность GLuc и CLuc, затем регистрировали значения люминесценции. Значения люминесценции GLuc были нормализованы относительно значений люминесценции кэпированной РНК CLuc.

Формула соотношения люминесценции GLuc, измерение люминесценции, уравнение для нормализованных значений, RLU.

* Люминесценция нетрансфицированных клеток была вычтена из значений GLuc и CLuc перед нормализацией.

Товарные знаки

BioLux является товарным знаком New England Biolabs, Inc.

TransIT является зарегистрированным товарным знаком компании Mirus Bio LLC.

MEGAclear является товарным знаком компании Ambion.

Обсуждение

In vitro транскрипция является полезным методом получения высоких выходов РНК для различных приложений. Основным преимуществом использования набора T7 High Yield RNA Synthesis Kit является то, что его состав был оптимизирован для достижения высокого выхода РНК. Кроме того, реагенты, входящие в набор, не содержат загрязняющих нуклеаз, что обеспечивает синтез высококачественных, интактных транскриптов РНК. Набор разработан с учетом высокой стабильности и гибкости, что позволяет использовать его для синтеза мРНК, РНК, меченной красителем, радиоактивно меченных зондов с высокой удельной активностью и кэпированной РНК. Руководство к набору содержит список конкретных протоколов и дополнительных материалов, необходимых для каждого из этих применений. В нем также содержится техническая информация по использованию продуктов ПЦР и синтетических ДНК-олигонуклеотидов в качестве матриц для транскрипции. Важно отметить, что набор для транскрипции может использовать только ДНК-матрицы, содержащие промотор T7.

Метод, описанный в данной статье, демонстрирует посттранскрипционное кэпирование РНК с помощью кэпирующего фермента Vaccinia, а также котранскрипционное кэпирование с использованием аналога структуры кэпа РНК. Мы показали, что оба метода позволяют синтезировать кэпированную РНК, которая функционально активна после трансфекции. Структура 5'-кэпа повышает стабильность РНК и эффективность трансляции, и поэтому имеет важное значение для экспериментов по микроинъекциям11 и трансфекции7. Метод котранскрипционного кэпирования позволяет получить 40-50 μg РНК с долей кэпирования ~80%. Важно отметить, что использование аналога кэпа РНК 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), который заблокирован по 3'-гидроксильной группе m7G, обеспечивает встраивание кэпа в правильной ориентации17. Для кэпирования больших количеств РНК можно масштабировать стандартные реакции для обоих методов кэпирования. Однако использование системы кэпирования Vaccinia будет более доступным вариантом с точки зрения стоимости, так как при котранскрипционном кэпировании используется аналог кэпа, который является относительно дорогим компонентом. Система кэпирования Vaccinia также является более предпочтительным методом, поскольку эффективность кэпирования при ее использовании составляет почти 100%.

Описанные выше методы кэпирования РНК позволяют синтезировать РНК со структурой кэпа 0 на 5'-конце. Структура кэпа 1 предполагает дополнительное метилирование по 2'-O-положению рибозного сахара первого нуклеотида на 5'-конце РНК. Было отмечено, что структура кэпа 1 повышает эффективность трансляции РНК18; она может быть сформирована с помощью 2'-O-метилтрансферазы20, 21.

Метод, описанный в данной работе, может быть использован для транскрипции, кэпирования и трансфекции любой желаемой мРНК. В данном протоколе специально использовались люциферазы GLuc и CLuc в силу их многочисленных преимуществ. Они секретируются непосредственно в культуральную среду, что позволяет избежать необходимости лизиса клеток. Кроме того, они создают высокую интенсивность биолюминесцентного сигнала, а анализы активности высокочувствительны и просты в исполнении. Важно отметить, что на экспрессию GLuc в клетках могут влиять различные факторы, помимо функциональности самой РНК. Примерами могут служить ошибки пипетирования, разное количество клеток в лунке, эффективность трансфекции и т. д. Для учета этих факторов используется нормализация данных. В нашем протоколе мы проводим ко-трансфекцию РНК CLuc в качестве внутреннего контроля вместе с РНК GLuc. При делении люминесценции GLuc на значения контроля CLuc данные нормализуются с учетом ошибок и вариабельности трансфекции19.

Раскрытие информации

Все авторы являются сотрудниками компании New England Biolabs, Inc.

Благодарности

Дунсянь Юэ, Бретт Робб, Джордж Тзерцинис, Таня Бхатия, Бретон Хорнблауэр.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для высокопродуктивного синтеза РНК T7New England BiolabsE2040S
3’-0-Me-m-7G(5’)ppp(5’Аналог структуры кэпа РНК New England BiolabsS1411S
ДНКаза I (без РНКаз)New England BiolabsM0303S
Система кэпирования на основе вируса вакциныNew England BiolabsM2080S
Набор MEGAclearAmbionAM1908
Спектрофотометр NanoDropThermo Fisher Scientific, Inc.
Набор Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent Technologies5067-1511
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA
<электронная микроскопия>ПереводНабор для трансфекции мРНК IT Mirus Bio LLCMIR2250
Классические жидкие среды HyClone*: среда Дульбекко’модифицированная среда Игла’среда с высоким содержанием глюкозыThermo Fisher Scientific, Inc.SH30285.01
Неessential аминокислоты HyCloneThermo Fisher Scientific, Inc.SH30238.01
Centro LB 960 Berthold Technologies
BioLux<электронная микроскопия> Gaussia Набор для люциферазного анализаNew England BiolabsE3300S
BioLux <электронная микроскопия>Cypridina Набор для определения люциферазыNew England BiolabsE3309S
Ингибитор РНказы, мышиный New England BiolabsM0314
Ингибитор РНказы, плацента человекаNew England BiolabsM0307
pCMV-GLuc Контрольная плазмидаNew England BiolabsN8081

Ссылки

  1. Lazarev, D., Manley, J. L. Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency. RNA. 13, 1546-1557 (2007).
  2. Donze, O., Picard, D. RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7. RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).
  3. Van Gelder, R. N. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  4. Schneider, J. Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments. BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).
  5. Conry, R. M. Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector. Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).
  6. Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5′ fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription. RNA. 9, 1562-1570 (2003).
  7. Warren, L. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  8. Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. 5'-Terminal structure and mRNA stability. Nature. 266, 235-239 (1977).
  9. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).
  10. Lewis, J. D., Izaurflde, E. The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export. Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).
  11. Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei. Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).
  12. Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus. J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).
  13. Martin, S. A., Moss, B. Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions. J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).
  14. Shuman, S., Moss, B. Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme. Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).
  15. Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus. J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).
  16. Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5′ Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP. Cell. 89, 951-961 (1997).
  17. Stepinski, J. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG. RNA. 7, 1486-1495 (2001).
  18. Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis. Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).
  19. Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance. Cell Notes. 17, 9-12 (2007).
  20. Barbosa, E., Moss, B. mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus. J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).
  21. Lockless, S. W. Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase. Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Кэпирование РНКнабор для высокопродуктивного синтеза РНК с помощью T7-полимеразыкэпирующая фермент вакцинияметод кэп-аналогаанализ люциферазной активностиочистка РНКколичественное определение с помощью NanoDrop
В пробирке транскрипции и укупорки мРНК люциферазы Gaussia Вслед за Трансфекция Сотовые HeLa
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.