Здесь мы демонстрируем наш протокол для выделения базальной и подслизистого железы воздуховодов клетки из мышиных трахеи. Мы также продемонстрировать метод инъекционного стволовых клеток в спинной панели жира мыши, чтобы создать В естественных условиях Модель подслизистого регенерации железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция базальных клеток и подслизистой Клетки Канальные железы от трахеи мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большая дыхательных путей непосредственно в контакте с окружающей средой и, следовательно, подвержены травмам от токсинов и инфекционных агентов, которые мы дышим в 1. Большая дыхательных путей, следовательно, требуют эффективного механизма ремонт защитить наш организм. Этот процесс восстановления происходит из стволовых клеток в дыхательных путях и выделения стволовых клеток из дыхательных путей имеет важное значение для понимания механизмов восстановления и регенерации. Это также важно для понимания ненормального ремонт, который может привести к заболеваниям дыхательных путей 2. Цель этого метода заключается в изоляции роман популяции стволовых клеток из мышей трахеи подслизистого протоки железы и разместить эти клетки в пробирке и в естественных системах модель для определения механизма ремонт и восстановление подслизистых желез 3. Это производство показывает методы, которые могут быть использованы для выделения и анализа канала и базальных стволовых клеток из больших дыхательных путей 3. Это позволит намдля изучения заболеваний дыхательных путей, таких как муковисцидоз, бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких. В настоящее время не существует методов для выделения подслизистых желез канала клетки и нет в естественных моделей для изучения регенерации подслизистых желез.
Протокол
План шаги
1. Вскрытие трахеи
2. Очистка трахеи и резко его
3. Ферменты пищеварения и переработки в суспензии отдельных клеток
4. Окрашивание для FACS и сортировки
5. Обработка отсортированных клеток в естественных условиях и в пробирке моделей
1. Вскрытие трахеи
- Усыпить мыши с внутрибрюшинной инъекции 0,1 мл mg/0.2 пентобарбитала.
- Разрезать брюшной стенки, и двигаться кишечник в сторону, чтобы разоблачить брюшной аорты, а затем вскрыть его.
- Откройте сундук, сокращая через диафрагму и передней грудной стенки с обеих сторон, чтобы открыть сердце и легкие. Продолжайте резать в шею удаления жира и слюнных желез, чтобы разоблачить трахеи.
- Удалить тимуса и сократить легких от его соединения ниже и сзади. Separели трахеи с пищеводом, вставив между ними щипцы затем разрезать трахею в ее верхней части над самым его связь с гортанью. Затем, удерживая трахеи с щипцами и анализировать его от привязанности и продолжают вниз, чтобы удалить его с сердца и легких ан-блок. Вырежьте сердце и легкие рядом с рубчиком, чтобы включить большую часть правого и левого главных бронхов.
- Поместите трахеи в небольшой чашке Петри содержащие накопительной среды на льду.
2. Очистка трахеи и резко его
- Под микроскопом рассечение, используйте очень тонкий момент щипцами (№ 5) и Vannas Тюбингена ножницы (ФСТ 15003-08 finescience.com) для очистки трахеи от всех других тканей прилагается к нему. Это включает в себя: лимфатические узлы, возвратный гортанный нерв, жиров, щитовидной железы и остальных легочных сосудов. В верхней части трахеи требует особого внимания, для удаления больших хрящей гортани без ущерба для крупнейших кучу SMG, которые подали между хрящом перстневидного и первый трахеи хрящевой кольца (C1) 4.
- Вырезать трахеи в верхней части и нижней части между С4 и С5, а затем разрезать обе части через просвет трахеи.
3. Пищеварение фермента и обработки в суспензии отдельных клеток (SCS)
- Инкубируйте нижней части трахеи в 1 мл 16 U диспазы в трубку Eppendorf при комнатной температуре (RT) в течение 30 мин, как описано выше 5. Затем добавить 0,5 мг / мл ДНКазы I в DMEM в течение дополнительных 20 минут при комнатной температуре.
- Снимите переваривается трахеи на свежий сбор среду в стерильные чашки Петри, и лишить поверхности эпителия под рассекает микроскопом. С помощью пипетки перенести среде, содержащей лишен эпителия в 50 мл коническую трубку.
- Спином вниз лишен эпителия при 1000 мкг при 4 ° C. Удалить супернатант и добавить 0,1% трипсина / ЭДТА и инкубируют при встряхивании йэлектронной трубы в 37 ° С инкубатор (200 оборотов в минуту) в течение 30 мин. После инкубации, используя 1.000 мкл наконечник, пипетки вверх и вниз, чтобы разбить скопления и образуют единую клеточной суспензии.
- Установите верхний трахеи в коническую пробирку, содержащую 1 мл 0,15% проназа. Затем инкубировали при 4 ° С в течение 4 часов.
- Аккуратно вихревой трубки, а затем поместить в трахею в свежей среде, сбор и подтвердить под рассекает микроскопом, что есть полный отрыв от поверхности эпителия (SE).
- Фарш трахеи с тонкой ножницы, чтобы открыть SMG отсеков, а затем инкубировать в течение еще одного часа при комнатной температуре проназа с медленным встряхивании.
- Спином вниз трахеи ткани, удалить проназа, добавить 0,1% трипсина / ЭДТА и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин при встряхивании, как указано выше.
- Прохождение усваивается клетками, скопления и все оставшиеся куски желез через 20G, 23G и 26G иглы с помощью 10 мл шприца. Повторите пассажи несколько раз с каждой иглы размером доуйти в отставку. Теперь, большинство клеток должно быть в SCS.
- Фильтр суспензии через 40 мкм фильтр затем промыть фильтр и спином вниз клетки. Тогда восстановить клетки в соответствующих объемов среды, рассчитывать клеток и немедленно приступить к FACS окрашивания и сортировки. Не оставляйте клеток в 4 ° C или на льду в течение нескольких часов, потому что мы обнаружили, что это влияет на жизнеспособность и существенно снижает сферу формирования эффективности.
4. Окрашивание для FACS и сортировка
- Возьмите достаточное количество клеток для подготовки неокрашенных и окрашенных одной трубы компенсации, то пятно остальной части клетки с первичными антителами, козы Trop2 и крысы ITGA6, в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем промыть водой с PBS или сбора среду, удаления супернатанта очень тщательно и нарушают клеточный осадок.
- Пятно с соответствующими вторичными антителами, инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин, промыть и удалить супернатант, а затем разорвать гранул.
- На FACSARIA, после изменения настроек напряжения и компенсации, ворота из мусора, очень маленькие клетки, клетки дублетов и мертвых клеток. Тогда, большинство клеток от SE должно быть положительным TROP2 в то время как 20-50% SMG клетки будут TROP2 + 6.
- Установить сортировку ворота для Trop2 ITGA6 + + клеток от SE (базальные клетки) и Trop2 + клеток (+ /-ITGA6 положительных клеток) от SMG (канал клеток).
5. Обработка Упорядочить Клетки для: экстракорпоральное культуры и в естественных условиях модели
5.1 В пробирке сфере формирования культуры 5-9
- Смешать 100 мкл "Фактор Роста уменьшить Matrigel" со 100 мкл полной среды 10,11 (см. Таблицу 1), содержащее до 50.000 отсортированных клеток затем положить эту смесь в верхней палате 24-и транс-а. Затем положить 400 мкл полной среды в нижнюю палату и инкубировать при температуре 37 ° C. Изменение среды в нижней палате каждый день и добавить дополнительные 100 мкл MatrigelКаждую неделю или раньше, если он становится тонким.
5.2 В модели естественных условиях
- Развести отсортированы осадок клеток в полной среде смешать 1:1 с матригель в концентрации 5,000-10,000 клеток в 50 мкл.
- Anesthetize получателя C57/BL6 мышей. Администрирование Carprofen (5 мг / кг) subcutaenously как анальгетик. Стерилизовать и брить их спинами затем сделать центральный продольный разрез кожи в верхней части спины. Разрез должен быть достаточно большим, чтобы определить место инъекции жира площадки, а также волдырь, которая формируется после инъекции. Используйте тупой стороной ножниц, чтобы расширить пакеты между кожей и задней стенки грудной клетки с обеих сторон для максимального доступа и визуализации.
- Определить медиальный край лопатки нажатием мыши лапы вверх и назад, чтобы увидеть движущиеся лопатки. Принимать по 50 мкл суспензии клеток в 300 мкл шприц инсулина BD, и внедрить его в жировой ткани только медиальнее лопатки и сбокупозвонков. Вы должны быть в состоянии видеть пузырь в противном случае вы слишком глубоко. Повторите то же самое с другой стороны, то клип или сшить разрез кожи. Проверьте мышей и дать Carprofen (5 мг / кг, SC) один раз в сутки в течение 48 часов.
- Через 3 недели, усыпить мышей с pentobarbatol (0,1 mg/0.2 куб.см, IP), откройте кожи, как указано выше и анализировать весь жировой ткани с обеих сторон с запасом, чтобы не пропустить любую ткань структуры, которые могли образоваться и расширен вокруг. Исправить в PFA и вставлять в парафин 12. Особая осторожность должна быть использована во время обрезки и резки блоков не обойти или игнорировать структуру. Лучше всего обрезать 40 мкм один раз, затем вырезать 4 мкм кусочек, положите его на стекло и рассмотреть его под микроскопом, чтобы подтвердить, есть ли "эпителиальных структур" в этой части блока или нет. Если ничего не видел, то обрезать еще раз и повторите этот шаг.
6. Представитель Результаты
Stripping из трахеи мыши приведет к оголенный трахею, которая видна с помощью световой микроскопии, как показано на рисунке 1а. рис. 1б показывает светлое зрения трахеи после удаления эпителия с подслизистых желез освобождения из ткани, напоминающие гроздья винограда.
Проназа удаляет ITGA6 эпитопов, и именно поэтому TROP2 канала клетки не могут быть разделены на ITGA6 + и - население. Тем не менее, диспазы, которая сохраняет ITGA6 эпитопов, переваривает все поверхности эпителия и канал клеток даже при очень коротком времени инкубации, и поэтому не может быть использован для разделения канала из базальных клеток 3. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии должна показать рассеяния вперед и боковой разброс участков, которые представлены на рисунке 2А. Хорошее разделение канала клетки от остальных, если трахеи клетки следует рассматривать с Trop2 антител в проточной цитометрии для люминесцентных клеток, активированных сортировонг (FACS), как показано на рисунке 2B. Сферы должны быть видны в матригель примерно через 1 неделю в области культуры и плотны на вид, как показано на рисунке 3. Эффективность этого процесса порядка 1-2%, а отдельные клетки будут присутствовать в матригель и, вероятно, представляют собой клетки из протоков подслизистых желез, которые не обладают способностью к самообновлению. Инъекции канал стволовых клеток в мышь жира результаты площадку в формировании подслизистых желез-подобные структуры, показана на рисунке 4. Они видели в блоках даже без окрашивания H & E. Они имеют сферическую форму и обладают центральным просветом. Многие сечения должны быть сделаны через жировой ткани, чтобы не пропустить эти эпителиальных структур.
Рисунок 1. Ферментативного расщепления трахеи эпителия. Удаление поверхностных эпителиальных клеток показано с BlacА стрелки, удаление клеток в протоках железы подслизистого показан зелеными стрелками. Оголенные трахеи, которые видны с помощью световой микроскопии показано через 30 мин диспазы пищеварения и через 4 часа проназы пищеварения.
Рисунок 2А. Я. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии показывать представитель рассеяния вперед и участков сторону разброс от мыши трахеи после удаления поверхностного эпителия. II. Представитель участков FACS для TROP2 выражение в воздуховоде клетки из мышиных трахеи.
Рисунок 2B. Я. Проточной цитометрии единого клеточные суспензии из лишили поверхности эпителия нижних двух третей трахеи мыши показывать представитель рассеяния вперед и участков сторону разброс. II. Типичный сюжет FACS из ITGA6 выражение в суrface эпителия. III. Другой представитель участок FACS переднего и бокового рассеяния от поверхности эпителия показывает обратно стробирования базальной клеточной популяции в зеленый цвет. внутривенно Типичные ITGA6 и TROP2 выражения клеточной популяции в зеленый цвет.
Рисунок 3. Время хода развития сфер. А. Канальные сферах. Сферы должны быть видны в матригель примерно через 1 неделю в области культуры и почти все они плотны на вид. Отдельные клетки, которые не образуют сферы также видели. (Шкалы = 50 мкм). B. Базальная сферы большего просвета и по внешнему виду. Отдельные клетки, которые не образуют сферы также видели. (Шкалы = 50 мкм).
Рисунок 4. Инъекции канал стволовых клеток в мышь жира результаты площадку в формировании подслизистых желез-подобные структуры. Представитель структурприведены в жировой ткани и некоторые из них показали производство муцина (светло-синий) с Alcian синие периодическому Шифф кислота пятна.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод, чтобы изолировать воздуховод и базальных клеток из дыхательных путей имеет важное значение для улучшения нашего понимания ремонт дыхательных путей и регенерацию и заболеваний дыхательных путей. Методы, описанные здесь, включают в себя несколько важных этапов. Во-первых, это оптимизированный ферментативных период пищеварения. Во-вторых, это создание единой клеточной суспензии через последовательные пассажи со все более высокие иглы для предотвращения избыточного сдвига клетки, но и разрушить клетки сгустки. Т...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы хотели бы отметить широкие Stem Cell Research Center FACS и особенно поблагодарить Джессика Скоулз и Felicia Codrea за помощь сортировки клеток. Работа финансировалась CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, Американского торакального общества / ХОБЛ фонда ATS-06-065, концерн фонда, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Центр торакальной онкологии программы / Рак легких SPORE, Университет Калифорнии рака Исследования Координационного комитета и Гвинн Hazen Cherry Мемориал Laboratories (BG).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | |
| Полной среде 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 мм) | Invitrogen | 15630 | |
| Бикарбонат натрия (3,6 мм или 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-глютамин (4 мм) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Пенициллина (100 ед / мл) | Mediatech | 30-001-ДИ | |
| Стрептомицин (100 мкг / м) | Mediatech | 30-001-ДИ | |
| Амфотерицин (0,25 мкг / мл) | Lonza | 17-836R | |
| Винсулина (10 мкг / мл) | Сигма | I6634 | |
| Трансферрина (5 мкг / мл) | Сигма | T1147 | |
| Холера токсина (0,1 мкг / мл) | Сигма | C8052 | |
| Эпидермального фактора роста (25 нг / мл) | BD | 354001 | |
| Бычий гипофизарный экстракт (30 мкг / мл) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки (5%) | Рыбак | SH3008803HI | |
| Ретиноевая кислота (0,05 мкм) | Сигма | R2625 | |
| Фактор роста Снижение Matrigel | BD | 354230 |
Таблица 1. Завершить медиа компоненты.
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Проназа | Roche | 10165921001 | Используется на 0,15%: -O / N при 4 ° С пищеварением, чтобы изолировать общего трахеи клетки (для культуры ALI) -4 Пищеварения час 4 ° C, чтобы изолировать SMG |
| Диспазы | BD Biosciences | 354235 | Используется на 16 единиц: 30 минут при комнатной температуре |
| ДНКазы I | Сигма | DN25 | Применяется при 0,5 мг / мл: 20-30 минут при комнатной температуре |
Таблица 2. Ферменты для ферментативного расщепления трахеи.
Ссылки
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E. A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential. Stem Cells. , (2011).
- Jeffery, P. K. Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands. Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).
- Rock, J. R. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).
- Goldstein, A. S. Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).
- Inayama, Y. In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells. Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).
- Ooi, A. T. Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer. Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
