Изоляция первичной микроглии с сотового неоднородность мозга необходимо исследовать их роль как в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол описывает механической изоляции, смешанная техника культуры клеток, что обеспечивает высокую производительность и высокую чистоту, жизнеспособных первичных клеток микроглии для В пробирке Исследования и последующих приложений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Первичная изоляция Микроглия из смешанного глиальных клеточных культур из тканей новорожденных мозга крысы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На микроглию приходится примерно 12% от общей клеточной популяции мозга млекопитающих. В то время как нейроны и астроциты считаются основными типами клеток нервной системы, микроглия играет значительную роль в нормальной физиологии мозга, контролируя ткани на наличие клеточного детрита и патогенов, а также поддерживая гомеостаз в паренхиме посредством фагоцитарной активности 1,2. Микроглия активируется при ряде повреждений и патологических состояний, включая нейродегенеративные заболевания, черепно-мозговые травмы и инфекции нервной системы 3. В условиях активации микроглия усиливает свою фагоцитарную активность, претерпевает морфологические и пролиферативные изменения, а также активно секретирует активные формы кислорода и азота, провоспалительные хемокины и цитокины, что часто запускает паракринный или автокринный цикл 4-6. Поскольку эти реакции микроглии способствуют патогенезу неврологических заболеваний, исследования, сосредоточенные на микроглии, являются обоснованными.
Из-за клеточной гетерогенности мозга в ходе экспериментов in vivo технически сложно получить достаточное количество материала образцов микроглии с высокой степенью чистоты. Современные исследования нейропротекторных и нейротоксических функций микроглии требуют рутинного технического метода для стабильного получения чистой и здоровой микроглии с выходом, достаточным для изучения. Мы представляем в тексте и видео протокол выделения чистой первичной микроглии из смешанных культур глии для различных последующих применений. Вкратце, данный метод предполагает использование диссоциированной ткани мозга новорожденных крысят для создания смешанных культур глиальных клеток. После достижения смешанными культурами глии состояния конфлюэнтности первичная микроглия механически выделяется из культуры путем кратковременного встряхивания. Затем микроглия высевается с высокой степенью чистоты для экспериментального исследования.
Принцип и протокол данной методики были описаны в литературе 7,8. Кроме того, хорошо описаны альтернативные методики выделения первичной микроглии 9-12. Гомогенизированную ткань мозга можно разделить с помощью центрифугирования в градиенте плотности для получения первичной микроглии 12. Однако центрифугирование занимает умеренное время (45 min), что может вызвать повреждение и активацию клеток, а также привести к обогащению микроглии другими клеточными популяциями. Другой протокол использовался для выделения первичной микроглии у различных организмов путем длительного (16 hr) встряхивания в культуре 9-11. После встряхивания супернатант среды центрифугируют для выделения микроглии. Этот более длительный двухэтапный метод выделения также может нарушить функцию и активацию микроглии. В нашей лаборатории мы в основном используем следующий протокол выделения микроглии по ряду причин: (1) первичная микроглия более достоверно имитирует биологию in vivo, чем иммортализованные клеточные линии микроглии грызунов, (2) минимальное механическое воздействие сводит к минимуму потенциальную клеточную дисфункцию или активацию, и (3) можно получить достаточный выход без пассирования смешанных культур глиальных клеток.
Важно отметить, что в данном протоколе для выделения микроглии используется ткань мозга новорожденных крысят; использование более старых крыс может существенно повлиять на выход, статус активации и функциональные свойства выделенной микроглии. Имеются данные о том, что старение связано с дисфункцией микроглии, усилением нейровоспаления и нейродегенеративными патологиями, поэтому в предыдущих исследованиях для лучшего понимания роли микроглии в нейродегенеративных заболеваниях, где старение является важным параметром, использовали микроглию взрослых особей ex vivo. Однако микроглию ex vivo невозможно поддерживать в культуре в течение длительного времени. Следовательно, хотя данный протокол продлевает жизнь первичной культуры микроглии, следует учитывать, что такая микроглия ведет себя иначе, чем микроглия взрослых особей, и при переносе результатов исследований in vitro на условия in vivo следует проявлять осторожность.
Протокол
1. Препарирование ткани мозга новорожденных крыс
- Холод Лейбовиц в L-15 условных СМИ (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) до 4 ° C. Теплый питательных сред (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин / стрептомицин) до 37 ° C. Подготовка 4 60x15 мм чашки Петри с 4-5 мл условно L-15 средств массовой информации на льду. Стерилизовать всех хирургических инструментов со 100% этанола.
- Промойте P2 новорожденных щенков рэп с 70% этанола. (Новорожденных крысят в возрасте от P1-P5 может быть использована в данном протоколе.)
- Быстро обезглавить крысу щенка стерильными острыми ножницами и удалить голову сразу на 70% этанола. Повторите эти действия для в общей сложности 5 крысят затем передать голову в физиологический раствор.
- Удалить все мозги из головы и место в чашку Петри с 4 - 5 мл L-15 решением (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) на льду.
- Повторите процедуры 1,2 - 1,4 для остальных щенков в помете.
- Удалить из оболочек головного мозга и передавать деIRED ткани головного мозга (например, кора головного мозга, мозжечок, весь мозг, и т.д.) в новую чашку Петри с 4-5 мл L-15 решением (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) на льду.
2. Подготовка смешанной популяции клеток глии
- Без повреждения мозговой ткани с помощью ножниц или лезвия, передает ткани с 10 мл пипетки на 50 мл стерильной коническую трубку.
- Центрифуга коническая в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант. Добавить 4-5 мл свежего L-15 средств массовой информации (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Внесите ткань вверх и вниз 10 раз стерильной пипеткой 10 мл.
- Поставьте клетку фильтр (100 мкм поры) на новый 50 мл коническую трубку. Внесите ткань вверх и вниз один раз стерильной пипеткой 5 мл, с пипеткой вплотную к клетке сито, отказаться от материала через ячейку фильтр в конической трубе.
- Промойте ячейки фильтра с 4-5 мл свежего L-15 средств массовой информации (Лейбовиц L-15 + 0.1% BS+ 1% Pen / Strep).
- Центрифуга коническая с напряженными клеток в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
3. Покрытие и обслуживания смешанных глиальных культурах клеток
- Для каждого крысят мозг обработки приготовления 1 стерильный Т-75 колбу, добавляя 12 мл культуральной среды (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин / стрептомицин) в каждую колбу.
- Аспирируйте супернатант из гранулированных клеток и добавить 5-6 мл культуральной среды в осадок клеток. Пипетировать вверх и вниз 10 раз с 10 мл пипетки.
- Передача равный объем клеточной суспензии для каждого Т-75 колбу.
- Инкубируйте колбы в 5% СО 2 инкубатор при 37 ° С в течение всего 1-3 недели.
- Фляги должны быть сначала выдерживают в течение 5 дней, а на пятый день, заменить культуру средств массовой информации в каждую колбу с 12 мл свежей среды и вернуться в инкубаторе. Затем каждые 3 дня, заменить условный СМИ в каждую колбу с 12 мл свежей среды для достижения слияния. Это необходимо делатьпе очень осторожно, не касаясь дна колбы, где клетки придают.
4. Изоляция и покрытие первичных Микроглия
- После смешанной глиальных культурах полностью сливающиеся, удалите колбы из инкубатора и охватывают колбы с крышками для предотвращения парафильмом газообмен с окружающего воздуха.
- Встряхнуть колбы на 100 оборотов в секунду (Лаборатория Companion SI-600, Jeio Tech) в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Сбор средств массовой информации из всех колбы с 10 мл пипетки, не нарушая астроцитов слоя на поверхности колбы. Место СМИ в 50 мл конические пробирки. Добавить свежие СМИ колб и возвращения колбы в инкубатор.
- Центрифуга конических труб в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант из всех конических труб. Сотовые гранулы клеток микроглии высокой чистоты. Ресуспендируйте гранул в 1 мл микроглии покрытие СМИ (DMEM + 10% FES + 1% пенициллин / стрептомицин).
- Подсчитайте плотность клеток в средах с помощью ресуспендированногогемоцитометра.
- Добавить соответствующий объем средства массовой информации микроглии покрытие для достижения 2-х 10e5 клеток на мл плотности. Пластина по мере необходимости для экспериментального анализа.
- Позвольте микроглии приложить на ночь.
5. Представитель Результаты
Протокол, описанный выше результаты в высокой степени чистоты первичных культур микроглии. Как определяется иммуногистохимии для макрофагов / микроглии клетки специфического маркера (Iba1), покрытие культур микроглии составляет> 90% чистой (рис. 2). Кроме того, для окрашивания астроцитов, олигодендроцитов и нейронов клетки специфических маркеров свидетельствует о минимальном загрязнении (рис. 2). После создания смешанных культурах клеток глии, микроглии могут быть выделены путем встряхивания до 4 раз подряд. Начальная изоляции микроглии даст примерно 2,2 х 106 клеток / мл или около 9 миллионов клеток на 10 колб и ожидаемую доходность уменьшается с каждым последующим шаке. Микроглия изолированы с помощью этого метода были успешно использованы для исследования фагоцитоза способности, функции, такие как продукцию оксида азота и токсичности нейронов (рис. 3) 13-14.
Рисунок 1. Обзор протокола для подготовки смешанных культурах клеток глии и изоляции первичной микроглии.
Рисунок 2. Изоляция высокой чистоты микроглии, что подтверждается иммуногистохимического анализа с использованием микроглии (МБА-1, красный), астроцитов (GFAP, зеленый), нейронов (NeuN, красный) и олигодендроцитов (СС1, красный) специфических маркеров. Окрашивание ДНК клеток в культуре DAPI (синий) также показано на рисунке.
Рисунок 3. Микроглия изолированы в методе ОПИСАНИЕкровати были использованы в ряде тестов, в том числе, но не ограничиваясь, фагоцитоз анализы, анализы функции и нейротоксичность исследований. В этих исследованиях мы обнаружили, что микроглии (МБА-1 позитивное, зеленый), при воздействии на управление (A) или LPS (B) рассматривается средствами массовой информации, повышение их фагоцитоз флуоресцентно меченных бисером латекса (красные), которые можно количественно ( C). Кроме того, ЛПС (1ng/ml) лечение может увеличить производство азотной окиси в микроглии (D). Наконец, как через Transwell вставки разделенных или прямой микроглии-нейронных культур, мы обнаружили, что микроглии инкубируют с LPS может вызывать гибель нейронов, как измеряется лактатдегидрогеназы (ЛДГ), выпуск (E, F).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В то время как этот протокол обычно используется для получения чистого и здорового микроглии для научных экспериментов, тщательного изучения технических аспектов в критических частях процедура позволит свести к минимуму различия в изолированных микроглии. Во-первых, во время рассечения ткани мозга от новорожденных крысят, работающих в своевременной необходимо минимизировать гипоксического и ишемического повреждения тканей. Тем не менее, важно также, чтобы полностью удалить менингеальные покрытия из головного мозга во вр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Финансируется очной программы в силовых университета Services.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| 60 мм х 15 мм чашки Петри | Фишер бренда | 0875713A | |
| Sharp рассечение ножницами | Изобразительных средств наук | 14094-11 | |
| Дюмон # 7b щипцы стандарта советы, изогнутые, 11см | Изобразительных средств наук | 11270-20 | |
| Дюмон # 5 щипцы стандарта советы, прямой, 11 см | Изобразительных средств наук | 11251-10 | |
| 50 мл конические пробирки | VWR | 89039-656 | |
| 5 мл серологических пипеток | Гренье Био один | 606180 | |
| 10 мл серологических пипеток | Гренье Био один | 607180 | |
| 100 мкм стерильный фильтр клетки нейлона | Сокол | 35-2360 | |
| 75 см 2 колбах культуры тканей | Гранулирование | 430641 | |
| Минимальный необходимый Дульбекко среде (DMEM) | Гибко (Invitrogen) | 31053-028 | |
| L-15 Лейбовиц в среду | Гибко (Invitrogen) | 11415064 | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки | Гибко (Invitrogen) | 16000-036 | |
| Плод лошадей сыворотки | Рыбак | SH3007402 | |
| Пенициллин, стрептомицин | Гибко (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% этанола | Компания Warner Грэм | 64-17-5 | |
| Фосфатный буферный солевой раствор, 10X, рН 7,4 | Качество биологических, вкл. | 119-069-131 | 1X в стерильной дистиллированной воды |
| Biohazard сумки | VWR | 14220-028 | |
| Гемоцитометра | Хауссер Научные | 1492 | |
| 6-и клеточных культур пластин с поверхностью cellBIND | Гранулирование | 3335 |
Ссылки
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
