Установка биологической зонды для кварцевых оптических биосенсоров использованием силана связующие вещества

Краткое содержание

Биосенсоры взаимодействовать со сложными биологическими средами и выполнение целевого обнаружения, комбинируя высокочувствительные датчики с высокой специфичностью датчиков прилагается к датчику с помощью модификации поверхности. Здесь мы демонстрируем поверхности функционализации кварцевых оптических датчиков с использованием биотина силана связующие вещества для преодоления датчика и биологической среды.

Аннотация

Для взаимодействия с биологическими средами платформы биосенсоров, такие как популярная система Biacore (основанная на методе поверхностного плазмонного резонанса (SPR)), используют различные методы модификации поверхности, которые позволяют, например, предотвратить загрязнение поверхности, регулировать ее гидрофобность/гидрофильность, адаптироваться к различным электронным средам и, что наиболее важно, обеспечить специфичность по отношению к интересующей мишени.^1-5 Эти методы расширяют функциональность высокочувствительных биосенсоров для применения в реальных условиях в сложных средах, таких как анализ крови, мочи и сточных вод.^2,6-7 Хотя коммерческие биосенсорные платформы, такие как Biacore, имеют хорошо изученные стандартные методы проведения таких модификаций поверхности, эти методы не были стандартизированы для других безмаркерных биосенсорных платформ, таких как оптические резонаторы с шепчущей галереей (WGM).^8-9

Оптические резонаторы шепчущей галереи (WGM) представляют собой перспективную технологию для безмаркерного детектирования широкого спектра веществ в ультранизких концентрациях.^6,10-12 Высокая чувствительность этих платформ обусловлена их уникальной геометрической оптикой: WGM-резонаторы удерживают циркулирующий свет на определенных целочисленных резонансных частотах.¹³ Как и в случае с SPR-платформами, оптическое поле не ограничено полностью устройством сенсора, а затухает; этот «эванесцентный хвост» может взаимодействовать с веществами в окружающей среде. Такое взаимодействие вызывает изменение эффективного показателя преломления оптического поля, что приводит к небольшому, но регистрируемому сдвигу резонансной частоты устройства. Поскольку оптическое поле циркулирует, оно может многократно взаимодействовать с окружающей средой, что приводит к естественному усилению сигнала и очень высокой чувствительности к незначительным изменениям условий среды.^2,14-15

Для проведения целевого детектирования в сложных средах эти платформы должны быть сопряжены с молекулой-зондом (обычно одной из половин связывающей пары, например, антителами / антигенами) посредством модификации поверхности.² Хотя оптические резонаторы с шепчущей галереей (WGM) могут быть изготовлены в различных геометриях из разнообразных материалов, наиболее распространенными являются силикатные микросферы. Такие микросферы обычно изготавливаются на конце оптического волокна, которое служит «стеблем», позволяющим манипулировать микросферами в ходе функционализации и экспериментов по детектированию. Для прикрепления молекул-зондов к их поверхности может применяться химия поверхности силикатов; однако традиционные методы, разработанные для плоских подложек, часто оказываются недостаточно эффективными для этих трехмерных структур, так как любые изменения поверхности микросфер (пыль, загрязнения, поверхностные дефекты и неравномерные покрытия) могут привести к серьезным негативным последствиям для их детектирующих способностей. В данной работе мы демонстрируем простой способ функционализации поверхности силикатных WGM-микросферных оптических резонаторов с использованием силановых связующих агентов для создания мостика между неорганической поверхностью и биологической средой путем прикрепления биотина к поверхности силиката.^8,16 Несмотря на то, что в данном отчете в качестве сенсорной системы используются силикатные WGM-микросферные резонаторы, представленные протоколы являются общими и могут быть использованы для функционализации биотином поверхности любого силикатного устройства.

Протокол

1. Фон

Биотин крепится к поверхности эти устройства с помощью простого, три этапа (рис. 1). Во-первых, очистить поверхность и заполните ее гидроксильных групп, подвергая устройства или кислородной плазмы или пиранья решение. Во-вторых, мы используем осаждения паров приложить силана средство связи прекращаются с первичным амином на гидроксильные группы путем гидролиза и реакции конденсации. В-третьих, мы придаем биотина на поверхность с помощью N-гидроксисукцинимида (NHS) эфир химии. Мы направляем заинтересованного читателя к нашей предыдущей работы для получения дополнительной информации о развитии этих технологий, а также объяснение нашей мотивацией для выбора этих методов ^8.

Успех этих реакций может быть оценена с помощью оптической и флуоресцентной микроскопии после того первичного амина, а также после добавления биотина. В то время как оптический мicroscopy могут быть использованы для определения протоколов поверхность функционализации привело к повреждению поверхности микросфер, или даже загрязнений, флуоресцентная микроскопия используется для проверки качества и равномерности покрытия поверхности молекулы биотина, а также способности биотина на поверхность, с которой связывается (strept) авидин. Для оценки охвата аминов на поверхности, мы использовали флуоресцеин изотиоцианат (FITC) флуоресцентного красителя, который реагирует с первичными аминами с образованием стабильных, ковалентная связь тиомочевины в микросферы. Texas Red флуоресцентного красителя, который был сопряженных с авидином используется для обозначения группы биотина на поверхность через биотин-авидин взаимодействия. В обоих случаях, красители были выбраны, которые могут взаимодействовать (либо через рецептор-лиганд или ковалентной связи) с функциональными группами на поверхности.

Здесь силана агента связи, которая имеет три уходящих групп и одну функциональную группу, обеспечивает мост ставкуween неорганические и органические поверхности молекулы зонда. Основная функциональность амин реагирует с эфирами количественно NHS формировать устойчивые связи амида. В этом случае мы используем молекуле биотина зонд которого валериановая боковой цепи была изменена с группой NHS эфира. В действительности, любой пробной молекулы, к которым группа NHS эфир может быть добавлен к поверхности, используя следующие протоколы. Кроме того, эти протоколы носят общий характер, и может быть использован для functionalize любой поверхности кремния устройства с биотином.

Основная проблема с этими протоколами на самом деле не в самой химии, а в обработке кремния микросферы. Пожалуйста, обратите внимание, что на протяжении протоколов, микросферы должны быть обработаны grapsing стебли слегка заостренными пинцетом. Это держит пинцетом и от себя микросферы, и позволяет легко осуществлять перевозки между шагами. Многие шаги в протоколе ниже, специально предназначенные для решения этого фактаили.

2. Изготовление микросфер

1. Построить жилье для хранения микросферы.
   1. Используя нож Exacto, нарезать ¼ в толстый кусок картона в 1 х 1 в квадрат, это лента на обычного размера стекло, и приложите 1 в разделе скотч, с конца встречи, чтобы сформировать рулон , на картоне.
   2. Это создает платформу, на которой микросфер может быть повышен и изолированы от окружающей среды, а также предотвращает повреждение их поверхности.
2. Используя ножницы, разрезать 3-дюймовый раздел оптического волокна с катушкой оптического волокна.
3. С помощью No-Nik волоконно-стриптизерши, лишить защитных полимерных покрытий из последних 0,5 дюйма конца отрезанный кусок волокна, оставив только ядро ​​кремния. Очистить поверхность от любых оставшихся полимера с Kimwipe смоченной метанола, осторожно вытирая волокно с Kimwipe.
4. С помощью голого волокна нож, обрезать зачищенный конец так-йна лишь около 1 миллиметра лишен волокно остается на конце волокна.
5. Поместите лишен конце оптического волокна на путь СО _{2-лазера,} заботясь, чтобы вертикального выравнивания волокон, что ее лишили концом вниз.
6. Включите СО _{2-лазера,} и направить ее к поверхности раздела конце оптического волокна. Лазер будет таять лишен конце волокна в сфере использования примерно 3,5% мощности в 2 секунды.
7. С помощью пинцета аккуратно понять основы (без оголенную часть оптического волокна) микросфер. Прикрепите стволовых ленты рулона на микросфер жилья. Стекло может быть самой хранятся в чашке Петри. Это позволяет для безопасного хранения микросфер.

3. Заполнение поверхности с гидроксильных групп

1. Использование пираньи решение:
   1. В 60 мл полипропилен флакон с крышкой откидной, подготовить решение пираньи (70:30 по объему дымящей H _{2 SO 4: H 2 O 2 (30% по массе)) с добавлением 5 мл перекиси водорода во флакон, затем на 11,6 мл дымящей серной кислоты. ВНИМАНИЕ: носить кислотостойкие перчатки.}
   2. Передача стекло, держа по крайней мере 1 микросфер, на флаконе. Микросферы должны быть в контакте с жидкостью, а жидкость не должны касаться картона. Регулировка громкости решения, если это необходимо.
   3. Аккуратно снимите стекло из флакона, и вставить его в другой пластиковый флакон, содержащий DDI H ₂ O. Пусть сидят образцы в раствор в течение 5 минут.
   4. Аккуратно снимите стекло из флакона, и поместить его духовке при температуре 80 ° С в течение 10 минут, чтобы высушить поверхность.
2. Использование лечения кислородной плазмы:
   1. Передача стекло содержащих хотя бы один микросфер в камеру кислородной плазмы.
   2. Установить давление кислорода 200 мторр и мощности до 120 Вт Выставьте образца в кислородной плазме на 2 милиnutes.
   3. Снимите стекло из плазменной камеры.

4. Установка силана связующие вещества на поверхность

1. Положите стекло, содержащие хотя бы один микросфер, в вакуум-эксикаторе в вытяжном шкафу.
2. Кроме того, в вытяжной шкаф, откройте бутылку силана агентом соединения (в данном случае, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) был использован), и поместите открыл бутылку в эксикаторе.
3. Замените крышку на вакуум-эксикаторе и прикрепите розетку порт аспиратор или линии дома вакууме.
4. Включите вакуумный дома или уровня воды, и эвакуировать вакуумном эксикаторе. После того, как вакуум образуется уплотнение между крышкой и основанием, начать отсчет времени реакции. Это позволит внести силана средство связи на поверхности в виде тонкой пленки.
5. Через 15 минут, выключить вакуум, и медленно открыть порт, чтобы воздух в эксикаторе. Для этого связующего, 15 минут достаточно, чтобы сформировать unifoгт монослоя на поверхности. Для других средств связи, время, возможно, придется скорректировать.

5. Установка биотин на поверхность

1. Примерно за час до присоединения биотин, подготовить 10 мМ раствор N-hydroxylsuccinimide биотин (NHS-биотин) в безводного диметилсульфоксида (ДМСО) в 60 мл флаконе полипропилена с крышкой на шарнирах.
   1. Если NHS-биотин хранился холодным, чтобы она могла уравновешивать до комнатной температуры массирование его.
   2. Разрушать ультразвуком решение в течение 1 часа, чтобы полностью растворить NHS-биотин порошка в растворителе.
2. Передача стекло содержащие микросферы в другой пластиковый флакон с микросферами на дне, и стебли в верхней части флакона.
3. Передача с помощью пластиковой пипетки соответствующего объема NHS-биотин решение вниз стороне флакона, за стекло (так, решение не касается микросфер, как это добавляется к флаконе).дд достаточно решением для покрытия поверхности микросфер.
4. Установите флаконы теперь содержащие микросферы и NHS-биотин в растворе ДМСО на качалке инкубатор (наклон лотка) в течение 30 минут при комнатной температуре, со скоростью и углом наклона в 5 мин и 5 градусов соответственно.
5. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки ДМСО с поверхности, и удаляет любые физически адсорбированной биотин, что на самом деле не привитых к поверхности.
6. Снимите стекло из флакона, и поместить его в духовке при температуре 80 ° С в течение 10 минут, или пока все капли воды удаляются с поверхности.

6. Флуоресцентная маркировка амин завершающим кремния

1. Для обозначения аминогруппами настоящее время после treatmЛОР с APTMS, подготовить FITC решение в затемненной комнате, растворив 1 мг FITC в 1 мл безводного ДМСО.
2. Разбавьте раствор в 6,1 добавлением 50 мкл FITC раствора на 1 мл 0,1 М буфере бикарбоната натрия.
3. Поместите раствор в 60 мл флаконе полипропилена с откидной крышкой, и аккуратно сдвиньте амин завершающим микросфер, который находится снова на стекло, на флаконе.
4. Поместите флакон в ледяной ванне, и пусть образца реагирует с FITC решение в течение как минимум 4 часа в темноте.
5. Удалите излишки флуорофора через два, 10 минут полоскания микросфер натрия карбонатного буфера. Как и прежде, заполнить 60 мл флакон с полипропиленовой крышкой с откидной буфера, и осторожно вставьте стекло в раствор, следя за тем, что решение распространяется только на микросфер, а не картонный корпус. Крышка флакона с алюминиевой фольгой и поместить во флакон на наклонном лотке установлен на 5 градусов и 5 мин, как раньше.
6. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O и покрыты алюминиевой фольгой. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки краски с поверхностью.
7. Аккуратно снимите стекло из флакона, а в сухом сушильном шкафу при температуре 80 ° С за 10 минут до съемки.

7. Флуоресцентная маркировка биотин завершающим кремния

1. Подготовьте 10 мкг / мл раствора Техас-красный авидин в фосфатном буферном растворе.
2. Добавить решение 60 мл флакон полипропилена с откидной крышкой, и аккуратно сдвиньте стекло содержащие биотин завершающим микросфер в раствор так, что микросферы просто покрыта раствором.
3. Реакция в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
4. Удалите излишки флуорофора через два, 10 минут промойтес микросфер в PBS буфера.
   1. Как и прежде, заполнить 60 мл флакон с полипропиленовой крышкой с откидной буфера, и осторожно вставьте стекло в раствор, следя за тем, что решение распространяется только на микросфер, а не картонный корпус.
   2. Крышка флакона с алюминиевой фольгой и поместить во флакон на наклонном лотке установлен на 5 градусов и 5 мин, как раньше.
5. Аккуратно снимите стекло из флакона, и осторожно вставьте ее в другой флакон заполнен DDI H ₂ O и покрыты алюминиевой фольгой. Поместите флакон от наклона лотка в течение 10 минут с той же скоростью и углом наклона, как раньше. Повторите этот шаг дважды с пресной водой, каждый раз. Это помогает удалить излишки краски с поверхностью.
6. Аккуратно снимите стекло из флакона, а в сухом сушильном шкафу при температуре 80 ° С в течение 10 минут до съемки.

8. Представитель Результаты

Правильно функциональными микросферс могут быть идентифицированы с помощью оптической и флуоресцентной микроскопии. Если поверхность функционализации сделано правильно, это должно привести к равномерно плотные покрытия биотин молекул на поверхности, а поверхность должна оставаться дефектов и загрязнений без после функционализации с целью поддержания их высокой чувствительности при обнаружении экспериментов. Оптическая микроскопия может быть использована для исследования последнего, а флуоресцентной микроскопии можно исследовать качество и однородность поверхности покрытия. На рисунке 2 мы показываем примеры правильного функциональными микросферы. Эти снимки показывают, что нет повреждений поверхности или загрязнения в результате функционализации (рис. 2а), а микросферы показывают единой, последовательной покрытие или аминогрупп (рис. 2б), или биотин группы (рис. 2) на поверхности .

Если микросферы не были функциональными правильно, оптических изображений микросфер шбуду выставлять поверхностного загрязнения, слипания или не равномерное покрытие, и очевидные дефекты поверхности, как поверхности трещины (рис. 3). Здесь мы видим типичный пример поверхностного загрязнения в результате слипания реагентов на поверхности.

Рисунок 1. 3-х ступенчатая схема реакции для крепления датчика молекул на поверхности кремния микросферы. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Silica микросферы. а) Оптические микрофотографии кремния микросферы заполняются гидроксильных групп с помощью воздействия кислородной плазмы, б) Флуоресцентные микрофотографии кремния микросферы заполняются первичные амины и помечены FITC краситель, в) Флуоресцентные микрофотографии кремния мильcrosphere заполняется биотин и помечены Texas Red-авидин сопряжены. Печатается с разрешения Soteropulos, CE, Хант, HK & Armani, А. М. Определение обязательных кинетики использованием шепот микрорезонаторах галерея режиме. Appl. Phys. Lett. 99, 103703-103703 (2011). Copyright 2011, Американский институт физики ^17.

Рисунок 3. Оптические микрофотографии неправильно функциональную сферу. Здесь вы можете увидеть пыль в правом верхнем углу поверхности, а также загрязнение расширения с поверхности. Кроме того, справа от оптического микросфер показывает небольшую дерн на поверхности.

Обсуждение

Как указано в протоколах, мы создали платформу жилье с помощью которого можно транспортировать кремния микросферы их стебли всей функционализации процесса. Это жилье платформа была создана в качестве решения для поверхностного загрязнения и повреждения, которые привели из микросфер соприкосновении со стенками из различных контейнеров, используемых в процессе функционализации. Мы поняли, что основная трудность возникла с постоянно присоединения и отсоединения отдельных микросфер для различных контейнеров в функционализац...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Метанол	Рыбак	67-56-1	ACS класса
Серная кислота	Рыбак	8014-95-7	Дымящей
Перекись водорода	Рыбак	7722-84-1	30 мас%
Aminopropyltrimethoxysilane	Рыбак	13822-56-5
NHS-биотин EZ компоновщик	Прокалывать	20217
Диметилсульфоксид	Рыбак	67-68-5	Безводный
Флуоресцеина изотиоцианат	Прокалывать	46425
Фосфатного буфера	Рыбак	7647-14-5	Порошок концентрата
Буфер бикарбонат натрия	Рыбак	NC0099321
Texas Red - авидин сопряженных	Прокалывать	A820
Оптоволокно	Ньюпорт	F-SC
Волоконно Stripper	Продажа волоконно инструмент	NN-175	Нет, Ник 175 мкм стриптизерши
Kimwipes	Рыбак	06666A
Голые волокон Кливер	Ilsintech	Cl-03A
Предметные стекла микроскопа	Рыбак	12-550B
Полипропилен Флаконы	Рыбак	03-341-75A	60 мл, откидной крышкой
Инкубация Rocker	VWR	12620-910
Вакуум-эксикатор	Рыбак	08-594-15B