Вращающейся системе культуры клеток эпителия, который позволяет клеткам расти в физиологических условиях в результате 3-D сотовой формировании совокупного описано. Агрегаты порожденных дисплей В естественных условиях-Подобных характеристик не наблюдается в обычных моделях культуры и служить более точным органотипической модельной системой для множества научных исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Культивирование и применение вращающихся стен биореактора полученных 3D эпителиальных клеточных моделях
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки и ткани в организме подвергаются воздействию условий окружающей среды, которые влияют на их архитектуру, межклеточные взаимодействия и общие функции. Чтобы модели клеточных культур in vitro точно имитировали исследуемую ткань, критически важным аспектом является среда выращивания культуры. В обычно используемых традиционных системах культивирования эпителиальные клетки размножаются на плоских двухмерных (2-D) непроницаемых поверхностях. Несмотря на то что традиционные системы культивирования позволили узнать многое, многие результаты не воспроизводятся в клинических исследованиях на людях или в эксплантатах тканей, что может быть следствием отсутствия физиологически релевантного микроокружения.
В данной работе мы описываем систему культивирования, которая позволяет преодолеть многие ограничения условий культивирования 2-D клеточных культур благодаря использованию инновационной технологии биореактора с вращающимся стенками сосудом (RWV). Мы и другие авторы продемонстрировали, что органотипические модели, полученные с помощью RWV, могут воспроизводить структуру, функцию и аутентичные реакции человека на внешние стимулы аналогично эксплантам тканей человека 1-6. Биореактор RWV представляет собой систему суспензионного культивирования, которая обеспечивает рост эпителиальных клеток в условиях низкого физиологического сдвига жидкости. Биореакторы бывают двух форматов: вращающийся сосуд с высоким аспектом (HARV) или медленно вращающийся боковой сосуд (STLV), которые различаются источником аэрации. Эпителиальные клетки добавляют в выбранный биореактор вместе с пористыми микроносителями, покрытыми коллагеном (Рисунок 1A). Клетки используют микроносители в качестве каркаса для роста во время постоянного свободного падения в биореакторе (Рисунок 1B). Микросреда, создаваемая биореактором, позволяет клеткам формировать трехмерные (3-D) агрегаты, обладающие характеристиками, подобными in vivo, которые часто не наблюдаются в стандартных условиях 2-D культивирования (Рисунок 1D). Эти характеристики включают плотные контакты, выработку слизи, апикально-базальную ориентацию, локализацию белков, характерную для in vivo, и дополнительные специфические свойства эпителиальных клеток.
Процесс перехода от монослоя эпителиальных клеток к полностью дифференцированному 3-D агрегату варьируется в зависимости от типа клеток1, 7-13. Периодический отбор проб из биореактора позволяет контролировать формирование эпителиальных агрегатов, маркеры клеточной дифференцировки и жизнеспособность (Рисунок 1D). После того как клеточная дифференцировка и формирование агрегатов завершены, клетки собирают из биореактора; при этом анализы, проводимые на 2-D клетках, могут быть применены и к 3-D агрегатам с учетом некоторых особенностей (Рисунок 1E-G). В данной работе мы подробно описываем этапы культивирования 3-D агрегатов эпителиальных клеток в системе биореактора RWV, а также предлагаем ряд возможных методов анализа, которые можно проводить с 3-D агрегатами. Эти анализы включают, помимо прочего, структурный/морфологический анализ (конфокальная, сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия), секрецию цитокинов/хемокинов и клеточную сигнализацию (цитометрический массив бусин и вестерн-блоттинг), анализ экспрессии генов (ПЦР в реальном времени), токсикологический анализ/анализ действия лекарственных средств и изучение взаимодействий между хозяином и патогеном. Использование этих методов анализа закладывает основу для более глубоких и обширных исследований, таких как метаболомика, транскриптомика, протеомика и другие приложения на основе микромассивов. Наша цель — представить нетрадиционный способ культивирования эпителиальных клеток человека для создания органотипических 3-D моделей, воспроизводящих ткани человека in vivo , в рамках простой и надежной системы, которая может быть использована исследователями с самыми разными научными интересами.
Протокол
Все шаги должны быть выполнены в соответствии BSL-2 в условиях ламинарном боксе.
1. Подготовка STLV биореактора
- Соберите STLV биореактора в соответствии с протоколом производителя и выполнять детоксикации протоколов для обеспечения стерильности в биореактор. Обложка открытых портов с Luer шапки и заполнить STLV с 95% этанола в течение 24 часов.
- Удалить этанола и заполнить STLV стерилизованной дистиллированной водой в течение 24 часов.
- Повторите шаг 1.2 с стерилизовать только дистиллированную воду.
- С помощью инструмента поставляется поставщиком, ослабьте все болты, колпачки и центр вилку из STLV и а....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Использование технологии RWV биореактор, представленные здесь может дать исследователям возможность для продвижения своей нынешней системе культуры клеток на более физиологически соответствующих органотипической модели культуры клеток. Ячейка RWV биореактор культуры система обеспечивает низкий микроокружения сдвига, что позволяет клеткам формировать 3-D сотовых агрегатов в естественных условиях подобные характеристики, включая плотные соединения, муцина производство внеклеточных процессов (например, микроворсин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Брук Хельм ее техническую экспертизу и Андрей Ларсена за его анализа белков. Эта работа была частично финансируется Альтернативы развития исследований Фонда (MMHK) грант NIH и NIAID передаваемых половым путем и противомикробных средств совместной научно-исследовательский центр IU19 AI062150-01 (MMHK). Мы выражаем глубокую признательность биологии размножения для повторного использования цифр.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Используется в разведении 1:500 |
| FACSDiva | BD | Проточный цитометр | |
| β-антитело tublin | Calbiochem | 654162 | Используется в разведении 1:5000 |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 программного обеспечения |
| Биореактор и компоненты | Synthecon | РКЦ-4 | |
| Сотовые фильтр | BD Сокол | 352340 | Размер пор 40 мкм |
| Конические трубки (50 мл) | Гранулирование | 5-538-60 | |
| Покровные | VWR | 48366067 | |
| Цитокинов шарик комплекты массив | BioRad | Пользовательские человека комплект | |
| Cytodex бисера | Сигма | C3275 | |
| DPBS | Гибко | 14190 | |
| ЭДТА | Сигма | ED-500G | Этилендиаминтетрауксусной кислоты |
| Эпителиальные специфических антител (ЕКА) | Chemicon | CBL251 | Используется в 1:50 разбавления |
| Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) | Гибко | 10438 | Тепло инактивированная |
| HARV (одноразовые) | Synthecon | D-405 | |
| Соляная кислота | Сигма | 258148 | 37% |
| Involucrin антител | Сигма | Я 9018 | |
| Микроскопа | VWR | 16004-368 | |
| МТТ реагент | MP Biomedicals, ООО | 194592 | 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-дифенил тетразолия метила |
| MUC1 антител (микроскопия) | Санта-Крус | Sc-7313 | Используется в 1:50 разбавления |
| MUC1 антител (проточная цитометрия) | BD Pharmingen | 559774 | Также называется CD227, использовать 20 мкл на тест |
| Параформальдегид | Электронная микроскопия наук | 15710 | Препарат до 4% в DPBS |
| Петри (маленький) | BD Сокол | 353002 | |
| Полистирол трубы с фильтром | BD Сокол | 352235 | |
| Полистирол проточной | BD Сокол | 352058 | |
| PR-антитело | DAKO | M3569 | Используется в разведении 1:100 |
| Продлить Золото | Invitrogen | P36931 | Монтаж средств массовой информации с DAPI |
| RNeasy комплект мини | Qiagen | 74903 | |
| Сульфат натрия додецилсульфата | Сигма | 71725 | |
| Стерилизация сумка | VWR | 11213-035 | |
| Краны (в одну сторону) | Medex | MX5061L | |
| Шприц (10 мл) | BD | 309604 | Луер-Лок наконечник |
| Шприц (5 мл) | BD | 309603 | Луер-Лок наконечник |
| Голубой Трипан | Invitrogen | T10282 | |
| VP5 антител | Санта-Крус | SC-13525 | ВПГ-2 антитела клона 6F10, используется в разведении 1:5000 |
Ссылки
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
