Количественные реального времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) представляет собой быстрый и чувствительный метод для исследования уровня экспрессии различных микроРНК (миРНК) молекул в опухолевых образцах. Используя этот метод выражения сотен различных молекул микроРНК может быть усилен, количественно и проанализированы с той же кДНК шаблона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение микроРНК в опухолях простаты количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
МикроРНК (миРНК) представляют собой одноцепочечные некодирующие молекулы РНК длиной 18–24 нуклеотида. Они участвуют практически в каждом клеточном процессе, включая развитие1, апоптоз2 и регуляцию клеточного цикла3. По имеющимся оценкам, миРНК регулируют экспрессию от 30% до 90% генов человека4, связываясь со своими мишенями — матричными РНК (мРНК)5. О повсеместном нарушении регуляции миРНК сообщалось при различных заболеваниях и подтипах рака6. Благодаря своей распространенности и уникальной структуре эти малые молекулы, вероятно, станут биомаркерами, терапевтическими агентами и/или мишенями следующего поколения.
Методы, используемые для исследования экспрессии miRNA, включают количественную ПЦР (кПЦР) с применением красителя SYBR green I, а также с использованием зондов Taqman. Для эффективного применения miRNA в клинической практике крайне важно, чтобы их определение в свежих и/или архивных клинических образцах было точным, воспроизводимым и специфичным. кПЦР широко применяется для валидации экспрессии miRNA при полногеномных анализах, таких как исследования с помощью микрочипов7. В данном протоколе использовались образцы пациентов, перенесших радикальную простатэктомию по поводу клинически локализованного рака предстательной железы, однако их можно заменить другими тканями или клеточными линиями. Образцы предстательной железы после резекции подвергали мгновенной заморозке в жидком азоте. Для последующего анализа собирались клинические показатели и данные динамического наблюдения за каждым пациентом8.
Количественное определение уровней miRNA в образцах опухолей предстательной железы. Основные этапы анализа опухолей методом qPCR включают: экстракцию тотальной РНК, синтез кДНК и детекцию продуктов qPCR с использованием специфических праймеров для miRNA. Тотальная РНК, включающая мРНК, miRNA и другие малые РНК, экстрагировалась из образцов с использованием реагента TRIzol. Для синтеза кДНК и проведения qPCR использовалась система miScript от компании Qiagen (Рисунок 1). Эндогенные miRNA не полиаденилированы, поэтому в процессе обратной транскрипции поли(А)-полимераза полиаденилирует miRNA. miRNA используется в качестве матрицы для синтеза кДНК с помощью олиго-dT и обратной транскриптазы. Универсальная тег-последовательность на 5'-конце олиго-dT праймеров облегчает амплификацию кДНК на этапе ПЦР. Амплификация продукта ПЦР детектируется по уровню флуоресценции, излучаемой SYBR Green — красителем, который интеркалирует в двухцепочечную ДНК. Специфические праймеры для miRNA вместе с универсальным праймером, который связывается с универсальной тег-последовательностью, обеспечивают амплификацию специфических последовательностей miRNA.
Наборы праймеров miScript Primer Assays доступны для более чем тысячи специфичных для человека miRNA и сотен специфичных для мыши miRNA. Для количественного определения экспрессии miRNA в данной работе использовался метод относительного количественного анализа. Чтобы скорректировать вариабельность между различными образцами, уровни экспрессии целевой miRNA нормируются по уровням экспрессии референсного гена. Выбор гена для нормировки экспрессии мишеней имеет решающее значение при использовании метода относительного количественного анализа. Примерами референсных генов, обычно используемых в этих целях, являются малые РНК RNU6B, RNU44 и RNU48, так как они считаются стабильно экспрессируемыми в большинстве образцов. В данном протоколе в качестве референсного гена используется RNU6B.
Протокол
1. Простата сбора проб
- Сбор образцов простаты во время простатэктомии. Образец располагается с анатомическим ориентирам. Предстательная железа и семенные пузырьки окрашены следующим образом: правый зеленый сторону, левую сторону синего.
- Случайные поперечные средней части простаты берется перпендикулярно поверхности ректальные, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C 9.
- Накопленные кусочки образцы фотокопий, ориентированный (передний, задний, правый и левый), разделенный на четыре части. Разделы сократить помощью криостата.
- Разделы окрашивали H & E и рассмотрены патологоанатомом, чтобы определить и разграничить опухоли по сравнению с нормальной области на окрашенных слайды и соответствующие изображения. Отмеченные области используются в качестве ориентира для обозначения районов, из которых, чтобы извлечь опухоль ткани, из которой РНК будет добываться на последующих этапах.
2. Изоляция Всего РНК, в том числе микроРНК, из образцов
- Место замороженных образцов простаты на сухом льду и со ссылкой на очерченные ксерокопию, вырезать небольшую часть опухоли предстательной железы (от 50 до 100 мг).
- Однородный ткани опухоли простаты в 1 мл TRIzol реагентов. Величины в следующих шагов основан на использовании 1 мл TRIzol реагентов.
Примечание: Здесь мы использовали TRIzol реагент для извлечения РНК, однако другие наборы, которые изолируют небольшой РНК-содержащих общую РНК также может быть использован.
- Инкубируйте усредненного образца в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Добавить 0,2 мл хлороформа образцов и энергично встряхивают в течение 15 секунд. Инкубируйте образцы в течение 3 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги при 12000 х г в течение 15 минут при 4 ° C.
- Передача бесцветной верхней водной фазы на свежий трубы, и добавить 0,5 мл изопропилового спирта.Инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифуги при 12000 х г в течение 10 минут при 4 ° C.
- Тщательно аспирации супернатант, не нарушая гранул содержащих РНК. Вымойте РНК гранул с 1 мл 75% этанола. Vortex образца и повторно осадка центрифугированием в течение 5 минут при 7500 х г при 4 ° C.
- Тщательно аспирации супернатант и сухие гранулы РНК в течение 5-10 минут, убедившись, что РНК гранул не полностью сухой. Повторно растворяются в нуклеазы воды без соответствующего размера гранул. Измерение концентрации РНК с использованием спектрофотометра NanoDrop 1000 (мера поглощения при 260 нм и 280 нм).
- Проверка качества и целостности образцов РНК с использованием Agilent биоанализаторе.
3. Обратной транскрипции РНК
- Обратной транскрипции РНК проводили с использованием miScript обратной транскрипции набора в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen). В комплект входятобратной транскриптазы и поли (А)-полимеразы. Буфер miScript РТ включает в себя Mg 2 +, дНТФ, олиго-дТ грунтовки, и случайных праймеров.
- Используйте от 10 мкг и 1 мкг РНК для синтеза кДНК. При использовании более 1 мкг РНК, расширения реакции линейно соответствующего объема.
- Подготовка мастер смесь, которая содержит 5X miScript РТ буфера (4 мкл), miScript обратной транскрипции Mix (1 мкл) и РНКазы без воды принести реакции на конечном объеме 20 мкл. Кроме того, включать шаблоны РНК (до 1 мкг) в мастер-микс.
- Инкубируйте образцы в течение 60 минут при 37 ° С и сразу же за инкубации в течение 5 минут при 95 ° C. Этот шаг может быть выполнен в машине ПЦР, нагревая блок, или водяной бане. Thermocyclers являются наиболее подходящими и точный метод. Хранить кДНК на льду на короткий срок, и -20 ° C для длительного хранения.
4. Создание калибровочной кривой
- До экспериментаiment с целевой микроРНК, стандартной кривой создается с помощью кДНК известных концентраций от их пропускные пункты (КП) (рис. 2).
- Приготовьте серию разведений в 2 раза, в 10 раз, 50 раз, 250 раз, и 1250 раз оригинальной кДНК пример, как известно, оказывают существенное выражение вашего гена.
- Запуск ПЦР как указано в разделе 5 "ПЦР в реальном времени для обнаружения микроРНК», с поправкой, что кДНК в серийных разведениях не статические 40x разведения.
- Выполнить анализ с использованием программного обеспечения RelQuant (Roche) для создания своих стандартной кривой.
Примечание: новый стандарт кривой должны быть созданы для каждого гена.
5. ПЦР в реальном времени для обнаружения микроРНК
- ПЦР в реальном времени для микро-РНК проводили с использованием miScript SYBR Green PCR Kit и miScript Primer Анализ в соответствии с инструкциями изготовителя (Qiagen). Подготовка мастер смесь, содержащая2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Универсальная грунтовка, 10x miScript Анализ Primer и РНКазы без воды. Подготовка мастер микс для 20 мкл реакционного объема.
- Грунтовка Анализ специфичные для микроРНК интерес. Чтобы восстановить 10x Анализ Primer miScript, центрифуги флакон кратко и добавьте 550 мкл ТЕ буфера, рН 8,0. Vortex флакон кратко перемешать, аликвоты праймеров для меньших объемах, и хранить при температуре -20 ° C. Два праймера требуется. Праймеры для гена-мишени и ссылки ген RNU6B является usedas ссылкой ген.
- Развести кДНК 40x и хранить дополнительные порции при температуре -20 ° C.
- кДНК служит в качестве шаблона для ПЦР. Используйте 2 мкл 40x разбавленных кДНК и обойтись в 20 мкл свет циклер капилляров (Roche).
- Добавить 18 мкл мастер микс каждый капилляр, и центрифуги использованием капиллярной адаптера.
- Поместите капилляров в капиллярных основе в режиме реального времени циклер, таких как LightCycler 3.5 Real-Time PCR System с 32-капиллярной карусель формате.
- Запустите программу ПЦР велосипедные следующим образом:
Для активации HotStarTaq полимераза, которая находится в 2х QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, предварительно инкубировать при температуре 95 ° С в течение 15 минут.
Вслед за 50 циклов:
Денатурация, 15 сек, 94 ° C;
Отжиг, 30 сек, 55 ° C;
Расширение, 30 сек, 70 ° C. - Выберите образец быть калибратор, и установить его нормированное количество цель 1. Сравните относительно выражения микроРНК во всех остальных образцов в калибратор.
Примечание: В рамках исследования, те же калибровки образец должен быть использован для обеспечения согласованности результатов.
6. Анализ данных
- Усиление кривые для реакции ПЦР изображены графически и численно методом молекулярно LightCycler Biochemicals программное обеспечение версии 3.5 (Roche). Количественная реакции в "Количественное" на вкладке,го экспорта данных в текстовый файл.
- Импорт данных в RelQuant программного обеспечения для анализа (Roche) для получения количественных результатов. Импорт отдельных файлов для целевой ген, ген ссылки и стандартные данные кривой.
- Укажите положение калибратор для целевой и ссылки ген. Также укажите позиций образцов. Данные в виде целевой ссылаться на соотношение различных образцов, деленное на цель ссылкой отношение калибратора. Калибровочной кривой ранее созданный для конкретной микроРНК и домашнее хозяйство гена используется как эталон для экстраполяции количественных данных для целей микроРНК неизвестной концентрации.
- Три повторяет образцы анализируются в группе и средние концентрации и стандартных отклонений от трех экземплярах рассчитывается. Если один из triplicates не согласуется с остальной частью набора, то он будет исключен программы.
7. Представитель Результаты
<с классом = "jove_content"> Пример КПЦР анализ образцов простаты показано на рисунке 3. Результаты показаны численно, так и в графическом виде. Графики, показывающие уровни экспрессии генов ссылки, U6, начинают экспоненциальное около цикл 20, в то время как экспрессия гена-мишени, Мир-98, показали, задерживается примерно на усиление цикла 25. Данные, полученные в этом эксперименте был экспортирован в текстовый файл и анализируются RelQuant программного обеспечения для анализа. Позиции капилляров содержащих калибратор и образцы указываются. 4 показано, как калибратор устанавливается равным 1, и выражение других образцов по сравнению с калибратора.
Рисунок 1. Различные шаги в miScript обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени.
Рисунок 2. Стандартной кривой создается с помощью серии разведений в 2 раза, в 10 раз, 50 раз, 250 раз, и 1250 раз оригинальной кДНК образца.
Рисунок 3. Рош молекулярной LightCycler Biochemicals программное обеспечение показывает всю информацию эксперимента графически, так и в текстовом режиме. Количественные реальном времени ПЦР-амплификации участков указывают на увеличение флуоресценции из разных образцов.
Рисунок 4. Данные были количественно, используя программное обеспечение для анализа RelQuant LightCycler. Как правило, три повторяет образцы анализируются в группе и образцы, которые производят результаты явно не исключены и средней концентрации и стандартных отклонений от трех экземплярах рассчитывается.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Аномальные проявления некоторых микроРНК были последовательно найдены в опухоли простаты по сравнению с нормальной тканью 10, и некоторые из этих микроРНК были названы как потенциальные новые терапевтические средства против рака простаты 11. Таким образом, аномальным уровнем экспрессии микроРНК может быть полезным диагностическим и / или прогностических биомаркеров. Real-Time КПЦР методологии, представленной здесь, представляет собой тест для точной количественной оценки уровней микроРНК в тканях о...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа финансируется Канадским онкологическое общество Научно-исследовательский институт, грант №. 019038.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| TRIzol реагентов | Invitrogen | 15596 | |
| miScript обратной транскрипции Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Анализы Primer | Qiagen | Эксперимент конкретных | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3,5 Real-Time PCR System | Roche | ||
| Свет Cycler Капилляры | Roche | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 спектрофотометр | Thermo Scientific | 2538 | |
| Agilent 2100 биоанализаторе | G2943CA |
Ссылки
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790(2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92(2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162(2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211(2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
